分子诊断在甲状腺髓样癌术前诊断中的应用

金明月 关海霞

根据起源细胞的不同，甲状腺癌可分为源自滤泡上皮细胞的分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC)、低分化型甲状腺癌和未分化甲状腺癌，以及起源于滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer,MTC),其中DTC最常见，是近年来导致甲状腺癌发病率大幅攀升的主要病理类型。MTC相对少见，仅占所有甲状腺癌病例的5%左右。但与DTC相比，MTC的侵袭性更强、预后较差，诊断时通常已局部进展或转移，可导致高达13.4%的甲状腺癌相关死亡[1]，侵袭性病例的10年生存率低于20%[2]。术前对MTC的诊断主要是对超声发现或证实的甲状腺结节进行细针穿刺细胞学检查(fine needle aspiration cytology，FNAC)和血清标志物测定等。随着对MTC分子致病机制和基因改变的认识，以及基因组学检测技术的快速发展，分子诊断有望在MTC术前诊断环节中扮演重要角色。

一、MTC的疾病特征

MTC的起源细胞甲状腺滤泡旁细胞又称C细胞，属于胺前体摄取及脱羧化(amine precursor uptake and decarboxylation,APUD)细胞之一，具有分泌降钙素(calcitonin,Ctn)、降钙素基因相关肽、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)等多种肽类或活性胺类物质的能力，因此MTC是一种神经内分泌肿瘤。

约75%的MTC为散发，常见于40～60岁人群，多表现为单个甲状腺结节，颈部淋巴结转移高发，受累的颈部淋巴结可作为疾病的首发症状[3]。散发MTC中一半左右的病例带有体细胞RET基因变异[2]。另外25%的MTC是遗传性疾病，以由胚系RET基因变异导致的2型多发性内分泌肿瘤综合征(multiple endocrine neoplasia type 2,MEN 2)为主[2]。MEN 2中，除MTC这个必备肿瘤之外，还可同时具有其他特征性的肿瘤组分和(或)病变，如嗜铬细胞瘤、甲状旁腺瘤、黏膜神经纤维瘤、皮肤扁平淀粉样变、先天性巨结肠等。MEN 2A占所有MEN 2病例的95%，典型病例发病年龄为30～40岁，包括MTC(100%发病)、嗜铬细胞瘤(约57%发病)和甲状旁腺瘤导致的原发性甲状旁腺功能亢进(约15%～30%发病)，特殊病例仅表现家族性非多发性内分泌肿瘤性MTC(familial MTC,FMTC)。而MEN 2B少见，中位年龄23～28岁，临床特点表现为无甲状旁腺功能亢进但伴明显发育异常，如马凡体型、漏斗胸、肠和口腔黏膜神经瘤病等，胃肠道症状如肠梗阻常是病人就诊的首发症状[4]。

二、MTC术前诊断环节中尚待解决的“短板”

与DTC类似，目前临床上对MTC进行术前诊断的重要手段是超声影像评估和FNAC[5-6]。超声检查虽然是甲状腺结节和颈部淋巴结评估的首选方法，但现有的甲状腺影像报告和数据系统(thyroid imaging reporting and data system,TI-RADS)中，提示甲状腺结节恶性风险的征象主要针对乳头状甲状腺癌，因此对MTC而言，诊断的灵敏度和特异性均有限。FNAC 作为一种快速、经济、安全的判别甲状腺结节良恶性的方法，尽管已被广泛用于临床实践，但在一项纳入15项研究、641例MTC病人的荟萃分析中显示，通过FNAC确诊的病例比例为56.4%(95%可信区间为52.6%～60.1%)[7]，意味着如果仅依据FNAC结果，40%的MTC可能被漏诊。

基于MTC的神经内分泌肿瘤特征，检测血清标志物Ctn水平(单独检测或联合CEA检测)已被用于术前诊断。血清Ctn是MTC的主要筛查指标，基础Ctn水平大于100 ng/L提示MTC[6]。有证据显示，Ctn较FNAC诊断MTC的敏感性更高[8]。但是，血清Ctn水平可受到多方面因素影响，如吸烟、饮酒、服用质子泵抑制剂等药物、患有某些疾病(C细胞增生、慢性肾脏疾病、小细胞肺癌和胃肠胰神经内分泌肿瘤等)[9]。血清Ctn水平处于高于正常上限但低于100 ng/L这一“灰区”时，诊断MTC的阳性预测值仅为5%，难以鉴别低体积MTC和C细胞增生等其他原因所致的Ctn升高[10]。此外，一小部分MTC病人由于病灶失分化或检测干扰等原因，其血清Ctn水平正常或检测不出，此时依赖Ctn会导致漏诊[11]。另一个血清标志物CEA虽然与MTC侵袭性相关[12-13]，但由于其并非仅由MTC特异性产生，故不宜单独用于MTC的筛查和诊断。

近年来，放射性核素功能/分子成像联合解剖/结构成像，特别是应用氟-18-脱氧葡萄糖(fluorine-18fluorodeoxyglucose,18F-FDG)、氟-18-二羟基苯丙氨酸(fluorine-18 dihydroxyphenylalanine,18F-FDOPA)和Ga-68标记的生长抑素类似物(68 Ga-SSA，SSA包括DOTATOC、DOTATATE、DOTANOC、DOTALAN)的正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)/计算机断层摄影术(computed tomography,CT)技术，大大提高了发现MTC病灶的敏感性。但鉴于放射性药物可及性和价格等因素，这类检查目前主要用于定位MTC术后的复发性病变[14]。

三、分子诊断在MTC术前诊断中的作用

分子诊断的发展依赖于对MTC分子特征的认识和基因组学检测技术的进步。目前,甲状腺肿瘤相关的分子诊断主要聚焦在基因变异和表达水平变化，其优点在于能够充分利用有限的标本。出于术前诊断的目的，分子诊断针对的标本主要包括甲状腺结节术前FNA标本和外周血液标本。

1.利用甲状腺结节FNA标本的分子诊断有助于术前确诊MTC:FNAC和血清Ctn在诊断MTC上仍有不足，利用FNA标本检测MTC相关的分子改变可以作为诊断的补充手段，特别对于临床疑诊MTC、FNAC报告不确定细胞学结果、血清Ctn处于灰区者等，分子诊断有助于准确判别出MTC，达到早期诊治和避免不必要手术的目的。

对MTC确诊有帮助的分子标志物主要是RET基因变异和RAS基因变异。RET基因变异是MTC的重要分子事件。RET编码酪氨酸激酶受体，激活突变后受体会发生结构性激活，成为MTC肿瘤发生的主要驱动因素[15]。1993年，在遗传性和散发性MTC中分别检测到胚系和体细胞的RET基因激活突变[16]。约25%的MTC带有胚系突变，38%的MTC带有体细胞突变，意味着RET激活突变在MTC病人的甲状腺原发灶中很常见。另一方面，甲状腺结节中的RET激活突变为MTC所特有，因此，若在甲状腺结节的FNA标本中检测到RET激活突变，则可确诊为MTC原发灶。除了RET基因突变，另有15%～25%的散发性MTC携带体细胞RAS基因变异[15]。有研究显示，RAS变异与RET变异互斥，17.6%的RET阴性MTC病例中存在RAS突变[17]。但RAS变异可以出现于各种病理类型的甲状腺结节，对MTC诊断的特异性差，需结合是否有其他提示诊断MTC的临床线索。

2.利用血液标本的分子诊断有助于诊断遗传型MTC：遗传型MTC包括MEN 2A(含经典型、伴皮肤苔藓淀粉样变、伴先天性巨结肠和FMTC)和MEN 2B，均由胚系RET基因突变导致。因此，对MTC病人、在儿童或婴儿期出现MEN2相关肿瘤(如甲状旁腺瘤、嗜铬细胞瘤等)表现者,皮肤苔藓样淀粉样变和先天性巨结肠病人中进行RET胚系突变检测，可以筛查出遗传型MTC的先证者。一旦发现先证者，在其一级亲属中进行RET突变检测，有助于诊断出家族中的其他MTC病人。尽管携带RET胚系突变基因者MTC发病年龄有早有晚，但有生之年发病率接近100%。因此，分子诊断带来的获益之一在于能够早期(甚至还未出现明显的甲状腺病灶时)甄别出遗传性MTC病人。在上述特殊人群中开展RET胚系基因突变筛查，以及在先证者一级亲属中利用分子诊断发现其他遗传性MTC病人，已经得到国内外指南的一致推荐[5,18]。

3.利用FNA和血液标本的分子诊断有助于在诊断MTC时预判病情：(1)利用FNA标本检测获得的肿瘤细胞RET基因变异信息有助于预判遗传性MTC的可能性。这是因为某些突变位点很少发生在散发性MTC中，如10号外显子的第609和611密码子、11号外显子的第630密码子、13号外显子的第768和790密码子、14号外显子的第804密码子以及15号外显子的第904密码子；而10号外显子的第618和620密码子、11号外显子的第634密码子、13号外显子的第768和790密码子、14号外显子的第883、891密码子以及16号外显子的第918密码子在遗传性MTC和散发性MTC中均可发生[16]。(2)文献显示，RET胚系突变的具体位点与MEN 2临床表型高度相关。因此，根据突变位点，有助于预判携带者的MTC和其他内分泌腺体肿瘤风险。例如携带D631Y、C634F/G/R/S/W/Y、A883F和M918T突变均提示较高的嗜铬细胞瘤发生风险[18]，因此对于存在以上突变的MTC病人还应进行嗜铬细胞瘤的筛查。(3)分子诊断还有助于预估MEN 2病例的MTC恶性度。根据RET的突变位点不同可进行风险分层[5,18]：RET M918T 突变提示最高风险，C634和A883F突提示高风险，而上述位点之外的突变提示中风险。RET胚系突变基因型还与MTC的发病年龄和进展年龄有关，携带C630R、C634Y、M918T者的最小发病年龄依次为1岁、10个月、2个月，携带M918T者最小的转移年龄为3个月[19]。一项全球48个多中心的回顾性分析报道了通过分子诊断锁定发病早、进展早的RET 918突变MEN 2B病例并及早给予干预(1岁之内预防性切除甲状腺)，能够给病人带来生存获益[20]。

除RET外，有研究探讨了以RAS变异或其他分子标志物预判MTC严重程度的临床价值。从现有数据可知，散发性MTC中体细胞RAS基因型与临床表型和严重程度的相关性不大[17]。近期有研究发现，另一种体细胞基因改变——细胞周期素依赖性激酶抑制剂2C(CDKN2C，即p18)缺失可能是预测MTC病情的新标志物。CDKN2C隶属于CDKN家族，通过与CDK4或CDK6相互作用来阻止Cyclin D-CDK4/6复合物的激活，从而阻滞细胞周期。CDKN2C缺失在散发性MTC中的发生率为21%，几乎对半分布于RET野生型和突变型病例中；MTC病人中，CDKN2C缺失者与无缺失者相比，远处转移发生率显著增加、生存期显著降低，如合并RET M918T突变则生存期进一步下降，提示联合检测体细胞RET和CDKN2C改变可能利于更好地评估MTC病情[21]。

4.利用FNA和血液标本的分子诊断有助于在诊断MTC时预测靶向药物：与DTC相比，MTC的侵袭性更高、预后较差，对于手术无法切除或术后出现复发进展的病例，靶向药物治疗可能是延长无进展生存期的希望。针对MTC的靶向药物主要包括多靶点酪氨酸激酶抑制剂和特异性RET抑制剂。前者以凡他尼布、卡博替尼和安罗替尼为代表，药物疗效并不依赖于特定的基因变异；而后者以普拉替尼和塞尔帕替尼为代表，在携带RET变异的MTC病人中表现优异[22-23]。因此，在诊断MTC时进行体细胞和胚系RET变异检测能够为未来一旦需要时选择合适的靶向药物做好准备。

综上所述，以RET基因检测为主的分子诊断在MTC的诊断中已凸显出多方位的价值，有望在弥补现有诊断手段的短板、早期甄别病人、预判病情和预测靶向药物等方面发挥重要作用。