建立2D-HPLC同时检测钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的方法

张 燕 ，张 锁 ，魏 玮 ，苏艳丽 *，丁 靖 ，赵彩萍 ，戴尊孝 ，王 慧

（1.西安市精神卫生中心，陕西 西安 710100；2.西安市药学（精神卫生）重点实验室，陕西 西安 710100*通信作者：苏艳丽，E-mail：645403932@qq.com）

钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱和异去氢钩藤碱等多种生物碱均来源于常用的中草药钩藤［1-4］，具有抗焦虑、降压、镇静、抗惊厥和神经元保护等药理活性，尤其对精神状态的改善具有重要价值。钩藤碱能抑制外周血管收缩，使血管阻力降低，血压下降，也具有抗血小板聚集和抗血栓的作用［5-7］。异钩藤碱具有持续的降压作用，扩张血管，减慢心率，对电位依赖性钙通道具有阻滞作用［8-9］。去氢钩藤碱有抑制呼吸中枢和离体肠管的作用，还能改善红细胞的变形能力，抑制不良因素对红细胞变形能力的损害。异去氢钩藤碱具有降压、镇静、抗惊厥和神经元保护等药理活性［7-9］。钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱以及异去氢钩藤碱对神经系统和心脑血管系统具有广泛的有益作用［10-14］。钩藤是我院抗精神分裂症组方消幻汤（清幻灵、清幻颗粒）［15］中的一味药材，基于钩藤药用价值的研究，需要对其有效药用成分（前述四种钩藤生物碱）的含量进行质量控制。目前报道的四种钩藤生物碱的高效液相色谱法（HPLC）和液质联用法（HPLC-MS）基于梯度洗脱，分析时间较长［16-17］，效率较低，且HPLC-MS和飞行时间串联质谱仪（Q-TOF-MS）设备昂贵［18-19］。故本研究拟建立二维高效液相色谱法（2D-HPLC），同时测定钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱四种钩藤生物碱含量，为钩藤药材的质量控制提供新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

FLC 2701全自动二维液相色谱系统（湖南德米特仪器有限公司），HC-3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），吉尔森移液枪（吉尔森科技有限公司），万分之一分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），XW-80A漩涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司），超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），Milli-Q Academic超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药与试剂

分析级甲醇（美国安可化学公司），BPI-1（LOT：20210412-1）、API-1（LOT：20210413-1）、CAA-1D（LOT：20210415-1）、MPI-1（LOT：20210310-1）、OPI（LOT：20210427-1），均购自湖南德米特仪器有限公司，钩藤碱对照品（LOT：C22M11S113789）、异钩藤碱对照品（LOT：P08A10S85061）、去氢钩藤碱对照品（LOT：MUST-12101703）、异去氢钩藤碱对照品（LOT：MUST-17092903）均购自成都曼斯特生物科技有限公司，钩藤药材（西安市长安大药房，产地广西）。

1.3 色谱条件

Aston SC2（3.5 mm×25 mm，5 μm）一维色谱柱，流动相为CAA-1；Aston SH C18（3.5 mm×10 mm，5 μm）中间色谱柱；Aston SCB（4.6 mm×125 mm，5 μm）分析色谱柱，1号泵流动相为三元流动相混合［O为OPI，A 为 BPI-1，B 为 MPI-1，A∶B∶O=45∶14∶41（v∶v∶v）］，2号泵流动相为水，3号泵流动相为CAA-1D；流速1.0 mL/min；柱温40℃；检测波长254 nm和245 nm；进样量500 μL。

1.4 溶液的制备

1.4.1 储备液配置

精密称取去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱的对照品2.2、2.2、2.2、2.0 mg，甲醇超声溶解并定容稀释至10 mL，制得上述钩藤生物碱对照品单标储备液浓度分别为220.0、220.0、220.0、200.0 μg/mL，置于-20℃冰箱储存备用。

1.4.2 对照品溶液配制

精密移取去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱对照品溶液，用甲醇将其稀释至浓度为11 000.00、2 750.00、687.50、171.88、42.97、10.74 ng/mL 的对照品溶液，精密移取钩藤碱对照品并用甲醇将其稀释至浓度为 10 000.00、2 500.00、625.00、156.25、39.06、9.77 ng/mL的对照品溶液。

1.4.3 药材供试品溶液制备

称取钩藤药材10 g置于容量为1 000 mL的烧杯中，加水至300 mL刻度线，加热至微沸后煎煮30 min，将药液过滤至另一烧杯，再次加水200 mL，加热至微沸后煎煮30 min获得药液，过滤后，合并两次滤液，置于4℃冰箱密封保存。

1.5 分析性能评价

1.5.1 专属性

按照分析条件，分析时间9.5 min，将制备的供试品溶液进样，得到目标物色谱保留时间。各峰间无干扰则专属性良好。

1.5.2 线性范围

分别取系列对照品溶液500 μL，在色谱和质谱条件下依次进样。计算被测物质在不同浓度下峰面积，与浓度进行线性回归，绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数，并以信噪比（S/N）=10为定量下限。

1.5.3 精密度、稳定性和重复性试验

取1份四种钩藤生物碱对照品混合溶液，在“1.3”项条件下进行峰面积测定，通过连续进样6次进行精密度试验。取1份四种钩藤生物碱对照品混合溶液，分别于0、2、6、10、12和24 h进样进行稳定性试验。取5份四种钩藤生物碱对照品混合溶液，连续进样进行重复性试验。

1.5.4 方法回收率试验

取1份四种钩藤生物碱对照品混合溶液，以相同体积分别进行“分析色谱柱”以及在“1.3”项条件下分析，各进样6次，计算方法回收率。

1.5.5 含量测定

分别3次吸取药材供试品溶液各1 000 μL，17 757×g离心10 min，进样500 μL，检测并计算四种钩藤生物碱的平均折合生药量。

1.6 统计方法

数据处理采用Lab Solution工作站，采用Excel进行计算，结果以（±s）表示，精密度、稳定性、重复性采用相对标准偏差（RSD）进行评价。

2 结 果

2.1 专属性

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱保留时间分别为9.08、8.31、7.23、7.91 min。四种钩藤生物碱的专属性色谱图见图1。

图1 四种钩藤生物碱的专属性色谱图Figure 1 Chromatogram of specific results of four Uncaria alkaloids

2.2 定量线性范围

四种钩藤生物碱回归方程的相关系数均＞0.99，其定量线性范围、检测下限及定量下限见表1。

表1 四种钩藤生物碱的回归方程、线性范围、检测下限及定量下限Table 1 Regression equation，linear range，lower limit of detection and lower limit of quantification for four Uncaria alkaloids

2.3 精密度、稳定性、重复性

去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱四种生物碱精密度RSD均＜4%，稳定性RSD均＜3%，重复性RSD均＜3%。见表2。

表2 四种钩藤生物碱的精密度、稳定性及重复性Table 2 Precision，stability and repeatability test of four Uncaria alkaloids

2.4 方法回收率

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的方法回收率分别为95.75%、93.63%、100.39%、101.38%，均在（100%±10%）范围内。见表3。

表3 四种钩藤生物碱的方法回收率试验结果（n=6）Table 3 Test results of recovery rate of four Uncaria alkaloids

2.5 含量测定

钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱折合生药量分别为（35.00±0.35）、（26.00±0.26）、（41.00±0.40）、（61.00±0.64）μg/g。见表4。

表4 四种钩藤生物碱的含量测定结果（n=3）Table 4 Determination results of four Uncaria alkaloids（n=3）

3 讨 论

在四种钩藤生物碱2D-HPLC建立时，可能存在被分析物质保留时间过短的问题，会导致分析的物质成分丢失，从而出现多个峰以及峰面积不足的问题。因此，本研究通过延长萃取时间来改善上述问题。此外，相关文献表明［20-21］，流动相的酸碱度也会对峰形和出峰时间造成影响。本研究中，当流动相A∶B的比例为50∶18时，异钩藤碱和异去氢钩藤碱两峰合并，出峰时间会后延；当A∶B的比例为42∶29时，异去氢钩藤碱与异钩藤碱两峰合并，时间后延约0.5 min；当A∶B的比例为45∶10时，去氢钩藤碱与异去氢钩藤碱分离度较好，第三个峰即异钩藤碱后移且与第四个峰钩藤碱合并；当A∶B的比例为45∶14时，得到的四种钩藤生物碱分离度都相对较好，最终确定方法中A∶B的比例为45∶14，如图1所示。此外，本研究选用254 nm、245 nm作为检测波长是综合了四种钩藤生物碱的检测波长，以确保分析基线平稳，信号灵敏。其中，254 nm检测波长下总峰面积较大，更为灵敏，故以254 nm作为测定波长及定量波长。本实验建立的2D-HPLC中，四种钩藤生物碱的出峰时间为5～9 min，相比于超高效液相色谱（UPLC）和HPLC出峰时间大多为10～30 min［22-23］，该方法分析更快，分离度较好。与质谱相比，2D-HPLC所需的设备成本更低，检测定量更稳定，适用于标准曲线的长期应用，可能是一种快速、高效、低廉的对四种钩藤生物碱进行质量控制的方法。

对四种钩藤生物碱的含量进行测定时，选用水煎法提取有效物质。水煎法是多数中药材最早使用的一种简易浸出方法，也是制备浸出制剂最常用的方法，但煎煮时间以及不同产地的钩藤药材对煎煮法提取的四种钩藤生物碱含量均有影响。本研究中，对钩藤药材供试品进行含量检测所得的结果与相关文献报道的钩藤生物碱含量接近［24-25］，表明该分析方法可以对钩藤药材水煎法及其派生的复方制剂中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱进行质量控制。

本实验建立2D-HPLC测定钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱四种生物碱含量，为钩藤生物碱成分的质量评价提供了快速、高效的分析方法。本研究虽然对药材进行了含量测定，但未对方剂中的四种生物碱进行追踪，后期将应用2DHPLC对抗精神分裂症清幻颗粒进行质量控制，并进一步监测患者体内药物浓度，让该分析方法更具有实践意义。