淫羊藿作用于膝骨关节炎的分子机制研究*

金久楚，卢敏，邝高艳，曹寅生

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208 2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410000

膝骨关节炎（Knee osteoarthritis；KOA）不仅在我国，甚至是全世界中老年人常见病、多发病，其在15岁以上人群发病率高达16%[1]。主要表现为膝关节疼痛，活动障碍以及肌肉力量减弱，X线显示：骨赘增加，关节间隙变窄等。目前西医主要用保护软骨，口服非甾体抗炎药的治疗方式，来缓解KOA的症状及进程。需长期吃药，但并没有根本上解决问题，且药物有诸多副作用[2]。因此寻找并开发出一种治疗KOA的新药，是当前研究的一大热点。

根据《中国药典》记载，淫羊藿具有补肾阳，强筋骨的功效；《神农本草经》记载其属于小檗科植物，性辛、甘、温；归肝、肾经。《本草正义》言“禀性辛温，专壮肾阳”。现代研究[3]表明淫羊藿具有促进成骨细胞形成、抗衰老、增强免疫功能等作用，LUO等[4]实验发现，通过上调AGG、PHrP基因以及下调Ihh基因的表达能够减轻关节软骨退变、增加关节软骨厚度。中药治疗KOA有非常大优势，但因中药作用靶点多，成分复杂、副作用小等特点，仅用现在的手段阐述其机制较为困难。网络药理学能够系统的反应药物对疾病干预的网络机制，结合生物信息学、计算机科学等对药物治疗疾病靶点进行预测，为临床系统治疗提供理论与实验基础

材料与方法

1 淫羊藿有效成分及靶点筛选

利用TCMSP数据库，设置类药性（Drug likeness，DL）≥0.18，口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30，获得淫羊藿有效成分及蛋白质靶点，然后根据文献补充为预测到的靶点，最后借助Uniprot数据库对靶点基因矫正及转换。

2 KOA相关靶点筛选

以Knee osteoarthritis为 关 键 词，用Genecards、TTD、OMIM、Drugbank数据库筛选出膝骨关节炎的主要靶点，去除重复值，并通过Uniprot数据库对靶点基因进行转换，再借助微生信平台（www.bioinformatics.com.cn）将“1.1”项与“1.2”获得的靶点基因，取交集后绘制Vene图。

3 淫羊藿成分-KOA靶点PPI网络构建

将交集靶点提交至String11.5数据库，并设置生物种类为“Homo sapiens”，最高置信度＞0.7，构建PPI网络模型[5]，并通过MCODE模块对PPI网络分析，得到潜在蛋白质模块，分析其生物学过程并对其功能描述。

4 淫羊藿成分-KOA靶点功能与通路富集分析

将交集基因导入metescape数据库，设P＜0.01，分析其生物学过程及通路并进行富集分析，然后利用R语言对数据进行可视化

5 关键靶点筛选

利用Cytoscape3.8.2内置工具对有效成分及靶点进行网络拓扑参数分析，包括紧密度（Closeness）、介度（Betweenness）、局部边连通性（LAC）以及度值（Degree），来筛选核心靶点。

6 分子对接

基于1.5项得到degree排名前3的靶点，将3个靶点与淫羊藿筛选得到的4个活性成分进行分子对接，用pymol进行可视化处理。

结果

1 淫羊藿有效成分及靶点获取

淫羊藿化学成分23种，并将预测的靶点去除重复后，获得213个靶点。见图1。

2 淫羊藿有效成分-靶点网络构建

用Cytoscape3.8.2对淫羊藿有效成分及其作用靶点进行网络绘制分析，共获得226个节点，229条关系。可以看出对应活性成分主要为槲皮素，其次为山奈酚、木犀草素等。如图1（其中节点越大，与该点的连线越多，Dgree越大，则越重要）。

图1 淫羊藿成分-靶点图

3 KOA靶点

用Genecards、TTD、OMIM、Drugbank数据库筛选出KOA靶点并去重后得到1206个靶点，药物疾病交集绘制Vene图（见图2）

图2 药物-疾病Vene图

表1 淫羊藿有效成分

4 淫羊藿治疗KOA关键靶点筛选与PPI网络构建

4.1 淫羊藿治疗KOA的PPI网络 将疾病药物的103个交集靶点提交String11.5数据库，设置置信度＞0.7，且隐藏游离节点得到淫羊藿治疗KOA的PPI网络，见图3，结果显示。

图3 交集靶点PPI

4.2 关键靶点筛选 根据交集PPI网络拓扑属性值，经过筛选得到关键靶点11个，根据Degree排序分别为TNF、AKT1、IL6、JUN、TP53、IL1B、VEGFA、RELA、CASP3、MMP9、CXCL8。如图4。

图4 关键靶点筛选

5 淫羊藿治疗KOA通路富集分析可视化

利用R语言对11个核心靶点进行信号通路分析，淫羊藿参与的主要生物学过程，有脂质与动脉粥样硬化、对脂多糖的反应等，参与的通路有IL-17信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等，见图5。

图5 GO分析及KEGG信号通路气泡图

6 分子对接

利用分子对接技术对结果进一步分析，根据成分-靶点图筛选得到的4个活性成分分别为槲皮素、山茶酚、木犀草素、8-异戊烯醇。根据PPI结果，取degree值前3的靶基因分别为TNF、AKT1、IL6，对接结果见表2。结果显示活性成分与靶基因的结合能在-8.9kcal/mol与-4.48kcal/mol之间，结合能的绝对值越高，说明淫羊藿活性成分与KOA的核心基因的亲和力越高。对结果进行分析发现，8-异戊烯醇与靶基因的结合能力较强。并用pymol进行可视化，如图6。

表2 淫羊藿活性成分与KOA靶基因对接评分表

图6 8-异戊烯醇与核心靶点分子对接图

讨论

膝骨关节炎在中医属于“膝痹”“骨痹”范畴，本病主要因外感风寒湿之邪，邪盛入里，气血亏虚，肝肾亏损，筋骨失养，不荣则痛；《类证治裁》云：诸痹……良由营卫先虚，腠理不密，风寒湿乘虚内袭……故在骨则重而不举，在血则凝而不流，在筋则屈而不伸。此病多因患者年老体弱，加之腠理不固，风寒湿三气内袭而为病。正虚血瘀是其基本病机，后面邝高艳等人[6]又将“毒、瘀”视为KOA的基本病机，认为久病必瘀，瘀而化内毒，虚瘀毒互结，加之外感风寒湿三邪，合而为痹。《张氏医通·卷五诸痛门》曰：膝痛无有不因肝肾学者。说明此病的发生与肝肾两脏的关系及其密切。

通过查阅文献，对于淫羊藿有效成分治疗KOA研究，槲皮素可降低THF-α、IL-1β等炎症因子的表达、影响相关信号通路以及抑制ECM酶的降解来治疗KOA[7-9]。山奈酚[10]为黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒的功能。能通过抑制丝裂原活化蛋白酶相关的细胞外信号调节激酶和抑制P38信号通路来降低炎症反应[11]，也有研究表明其可通过降低IL-1β来抑制软骨细胞促炎介质的表达[12]。木犀草素能够降低NO、PGE2的生成和COX-2等的表达，来防治关节软骨的破坏和Ⅱ型胶原的表达[13]。也有研究表明，木犀草素能与MMP1和MMP3结合，下调其表达量来缓解KOA的炎症反应[14]，也能保护软骨细胞，减轻软骨变性[15]。

TNF、AKT1、IL6是治疗KOA的主要靶点，TNF是一种促炎细胞因子，其能促进滑膜成纤维细胞释放基质金属蛋白酶（MMPs），从而导致软骨被破坏，并通过NF-kB途径抑制软骨生成[16]。AKT1被活化后能上调CyclinD1，促进细胞增殖，并抑制细胞凋亡[17]。有研究表明[18]AKT信号通路能够有效减缓KOA的进程。IL6与TNF都是促炎因子，与TNF不同的是，IL6可以增强TNF在关节病中的作用，且还能通过信号传导、转录激活等途径诱导软骨细胞分解代谢，加重KOA的形成[19]。所以淫羊藿可能是通过调节这些核心靶点来达到治疗KOA的作用的。

研究结果表明淫羊藿是通过不同的治疗靶点作用不同的信号通路来治疗KOA的，体现了淫羊藿多靶点、多通路联合的作用特点。可为临床挖掘开发治疗KOA的特效药提供科学依据，也为淫羊藿的疗效评价指标提供参考。但网络药理学方法预测靶点具有一定的局限性，只能通过大量的数据计算进行筛选，后续会进一步用实验来佐证该研究。