重组乳酸菌用于疾病治疗和预防的研究进展

林炫财,陈希玲,许森宝,白杨,张亚历

【提要】 乳酸菌在食品工业中有着悠久的使用历史，并且由于其安全性、内在的有益健康效应和巨大的生物技术潜力，在治疗中也呈现越来越大的吸引力。随着黏膜免疫的发展，对乳酸菌表达系统的研究主要集中在不同位置抗原表达的遗传工具的产生上。目前已知的能够使用乳酸菌作为载体来递送各种的治疗分子，主要是通过分泌或表面展示，它们被用于治疗或预防多种疾病：炎症性肠病、感染、自身免疫性疾病，甚至癌症。本文回顾了有关使用重组乳酸菌作为黏膜递送载体和相关健康益处的相关数据，讨论了它们用于递送治疗性蛋白质的用途，同时也关注了治疗性肽的递送，重点是最常用的乳球菌属和乳酸杆菌属。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能分解碳水化合物产生大量乳酸的细菌统称，主要包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)及链球菌属(Streptococcus)等43个属。由于在人类营养中的长期安全使用，它们已被美国食品和药物管理局认可为安全的，并且通常用作食品工业中的发酵剂。它们的安全状态、益生菌活性和通过胃肠道(gastrointestinal tract，GIT)的存活能力使这些细菌成为治疗分子黏膜靶向给药的极好候选者。LAB的特定菌株被用作人类和动物健康的益生菌，因为它们可以通过产生生物活性代谢物、调节黏膜免疫和肠道通透性，在维持胃肠道稳态和影响其他器官方面发挥着至关重要的作用[1]。重组LAB介导的黏膜疫苗递送，特别是通过鼻腔或口服免疫，比传统全身疫苗的静脉或肌肉注射更适用和方便，同时，通过黏膜递送可以增强慢性疾病和黏膜感染治疗蛋白的效力和特异性。这种方法也可以减少与此类蛋白质的经典全身给药途径造成的相关潜在副作用[2]。

1 乳酸菌作为黏膜递送载体的优势

近年来，黏膜给药免疫因其卓越的特性和针对多种微生物病原体的应用而备受关注。除了激活适应性免疫反应外，它们还可以保护黏膜表面免受感染、防止抗原降解并促进GIT的吸收。口服或鼻内施用的可溶性蛋白质的免疫原性通常较低，而通过将蛋白质耦联至细菌表面或通过基因工程细菌产生所需抗原可显著增强免疫原性。LAB是非病原微生物，被认为比某些减毒载体更安全，这使它们成为开发黏膜疫苗的有利候选者[3]。LAB可以在三个不同的细胞位置产生所需的抗原：①细胞内，这使蛋白质能够逃脱恶劣的外部环境条件(例如极酸的胃液环境)，但需要细胞裂解才能使蛋白质释放和递送，②细胞外，允许将蛋白质释放到外部介质中，并且与环境(食品或消化道)直接相互作用，③细胞壁锚定，结合了其他两个位置的优点(即细胞壁锚定蛋白与环境之间的相互作用，以及防止蛋白降解)[4]。研究表明，通过暴露于LAB表面的细胞壁锚定抗原获得的免疫反应较其他两种方式更优[5]。口服LAB可以在暴露于胃酸和与胆汁接触后存活下来，从而被吸收到黏膜免疫系统的诱导位点，例如派尔集合淋巴结。此外，通过口腔、鼻内或生殖器途径对LAB进行黏膜给药可以刺激黏膜和全身免疫反应。它们引发分泌型IgA产生的能力是LAB作为黏膜疫苗的主要优势之一[6-7]。目前，许多抗原和/或细胞因子已在重组LAB中成功表达，并且这些重组LAB的黏膜给药已被证明可引发全身和黏膜免疫。

2 重组乳酸菌应用于疾病治疗和预防

2.1 炎症性肠病

炎症性肠病(inflammation bowel disease，IBD)，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(crohn's disease，CD)，是一种慢性炎症性疾病，其特征是胃肠道中的免疫反应失调，症状包括腹痛、肠痉挛、腹泻、疲劳、发烧、体重减轻和食欲不振等。皮质类固醇、硫嘌呤和具有免疫调节作用的抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α ,TNF-α)抗体可用于治疗IBD。其中TNF-α是最有效的，但会导致严重的副作用并且成本高。第一次报道使用重组LAB治疗IBD是2000发表的，Steidler等[8]人描述了分泌型白介素(Interleukin，IL)-10重组乳球菌在两种结肠炎小鼠模型中的应用，而后有几项研究同样使用重组乳球菌递送IL-10。结果共同表明，口服重组乳球菌分泌IL-10可降低肠道通透性、改善肠道功能障碍并增强小鼠的免疫功能，重组乳球菌显著缓解了结肠炎小鼠的肠道炎症[9-10]。Henri Braat等[11]人使用IL-10重组乳球菌进行了小型I期临床试验，结果表明该策略对患者来说既安全又具有生物学意义。Motta等[12]人的研究表明，在急性和慢性结肠炎的小鼠模型中，口服表达丝氨酸蛋白酶抑制剂-弹性蛋白酶抑制剂(Elafin)的乳酸菌可降低肠道炎症并恢复肠道稳态。Humaran等[9]人比较了分泌①IL-10或TGF-β1作为抗炎细胞因子，以及分泌②Elafin或白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的不同重组乳球菌对IBD模型小鼠的功效，结果表明，在该IBD模型小鼠中，使用表达抗蛋白酶(Elafin或SLPI)的乳球菌比使用表达抗炎细胞因子(IL-10或TGF-β1)的乳球菌在减少肠道炎症方面更有效。krlec等[13]人研究发现，分泌BPC-157的乳球菌能显著降低成纤维细胞模型中活性氧簇的产生，表明其在治疗肠道炎症方面的潜在益处。Wong等[14]人发现，在乳球菌中表达的组织蛋白酶抑制素(Cathelicidin)可以有效地恢复结肠炎小鼠的黏膜完整性并增强炎症结肠组织的黏膜修复。Shigemori等[15]的研究发现，口服分泌白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)的重组乳球菌可抑制急性结肠炎小鼠的体重减轻和降低疾病活动指数评分。Liu等[16]人发现，口服分泌胰岛素样生长因子I(IGF-I)的重组LAB可减轻结肠炎模型小鼠的症状和疾病发展。

2.2 感染

重组LAB介导的黏膜疫苗递送，特别是通过鼻腔或口服免疫，比传统全身疫苗的静脉或肌肉注射更适用和方便，同时，通过黏膜递送可以增强慢性疾病和黏膜感染治疗蛋白的效力和特异性。在过去的研究中已经构建了不同的重组LAB来传递来自病毒、细菌、真菌或寄生虫病原体的抗原，目的是针对感染进行黏膜接种[17]。Wells等[18-19]人使用活的乳球菌递送疫苗抗原。他们构建了表达破伤风毒素片段C(TTC)的重组乳球菌，通过比较口服和鼻腔给药产生TTC的活乳球菌，观察对小鼠产生的保护效果。结果发现，虽然保护功效相同，但鼻腔免疫比口服给药引起更高水平的血清IgG和黏膜IgA。Wang等[20]人研究表明，将表达高致病性禽流感病毒蛋白血凝素-1(HA-1)的乳酸杆菌口服给药于正常小鼠，最终提高了黏膜中特异性抗HA-1 IgA抗体和血清中IgG的产生，以及脾脏T淋巴细胞的增殖反应。在一项针对禽流感病毒(AIV)的口服疫苗试验中，Shi等人通过将表达H9N2 AIV的HA基因的重组乳酸杆菌(NC8)口服给药于小鼠，发现重组NC8菌株能诱导小鼠黏膜和全身免疫反应，促使sIgA、IgG和血凝抑制抗体的产生，并对小鼠遭受H9N2病毒攻击时提供免疫保护[21]。Zhou等[22]人通过给鸡口服表达H9N2 M1-HA2融合蛋白的乳球菌菌株，最终发现该重组菌株可以很好的诱导黏膜保护功能和全身免疫。Belkis Marelli等[23]人构建了产生轮状病毒刺突蛋白亚基VP8的重组乳球菌菌株，给小鼠口服后其体内产生显著水平的肠道IgA抗体，并且观察到实验组小鼠比对照组明显阻断了轮状病毒感染。Berlec等人[24]构建了表达高免疫原性HAV抗原VP1-P2a的乳球菌，结果表明该抗原在乳球菌中成功表达，并在小鼠口服后引起显著的全身体液免疫反应，但实验组小鼠体内产生的IgG不能中和HAV，表明特定的IgG不能结合病毒颗粒并阻止它们感染靶细胞，这需要进行后续的研究。Lin等人[25]构建了分泌外源性导管素的重组乳球菌，研究结果表明口服重组菌小鼠显著增加了黏膜导管素水平并减少了幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染和相关炎症。Zhang等人[26]构建了携带来自H.pylori的Lpp20基因的工程化乳球菌，并且证明该工程菌株诱导血清IgG水平显著升高，表明Lpp20通过重组乳球菌传递，可以有效地转移到黏膜免疫位点并引发显著的免疫反应。Soodabeh等人[27]构建了分泌I型菌毛黏附素(FimH)的重组乳球菌，体外实验表明重组乳球菌的生物膜可以显著减少泌尿病原体生物膜的形成，并且体内实验表明经尿道给予重组乳球菌能明显抑制尿路致病性大肠杆菌定植和降低尿路感染的风险。尽管黏膜疫苗接种作为针对多种抗原的抗感染方法具有独特的优势，但这些疫苗中的大多数仍处于实验阶段，目前只有少数被批准用于人类和动物用途。

2.3 自身免疫性疾病：过敏和糖尿病

LAB在治疗过敏症和I型糖尿病中的应用已得到广泛研究。通过黏膜途径致敏比皮下注射有两个优点，即口服给药和提高有效性。过敏原特异性免疫疗法是目前治疗过敏性疾病的有效治疗方法，但它需要在3～5年内重复施用过敏原提取物，并且通常会引起不良事件的发生。许多益生菌菌株在过敏性疾病的治疗中显示出有益的作用，目前已陆续出现了表达相关过敏原的重组LAB，用于产生和/或递送过敏原或过敏原衍生肽至黏膜表面以诱导耐受性[28]。在Kayo等人[29]的一项研究中，表达日本雪松花粉过敏原Cryj1的重组乳酸杆菌口服给雪松花粉症的小鼠模型，结果表明，使用携带Cryj1的乳酸杆菌进行口服疫苗接种可改善雪松花粉症小鼠模型的鼻部症状以及产生过敏原特异性IgE反应。而Minic[30]等人则将Fes p1过敏原共价连接到植物乳杆菌细胞壁上，其在小鼠模型中的作用评估表明，口服重组和非重组活植物乳杆菌都减少外周血嗜酸性粒细胞并增加血清IgG2a水平，这可能是植物乳杆菌本身的作用，而用重组乳杆菌治疗的小鼠血清IgA水平明显增加，表明重组植物乳杆菌表达的Fes p1可作为特异性过敏原并增强了有益的治疗效果。同样，一项研究将尘螨过敏原Der p2重组到乳球菌上，并通过口服重组菌的方式在Der p2致敏BALB/c小鼠模型中评估了它们的保护作用。结果实验组小鼠明显降低IgE水平并减少了由Der p2引起的肺部炎症反应。同时也说明血清中特定IgG2a的增加和肠系膜淋巴结中调节性T细胞的增殖与保护性黏膜反应相关[31]。

除了过敏，重组LAB被认为是I型糖尿病现有疗法的潜在替代品，I型糖尿病也是一种自身免疫性疾病，其特征是致病性自身反应性T细胞选择性破坏产生胰岛素的胰腺β细胞。它通常通过基于抗体的免疫疗法和免疫抑制药物进行管理。然而，这些药物无法区分自身和非自身免疫效应物。因此，基于抗原的免疫疗法被认为是治疗自身免疫疾病最有潜力的方法，此疗法可选择性地作用于疾病相关的T细胞并具有保护免疫系统的功能[32]。Ma等人[33]发现，口服表达融合蛋白HSP65-6P277重组乳球菌的非肥胖糖尿病小鼠，可预防高血糖、改善葡萄糖耐量和减少胰岛炎症。Robert等人[34]的研究中，他们构建了分泌谷氨酸脱羧酶(GAD)-65和IL-10的乳球菌，通过口服给药，最终稳定了近期发病的非肥胖糖尿病小鼠的胰岛炎症、保留了功能性β细胞质量，并使小鼠恢复了正常血糖。 另一项研究中，Takiishi等人[35]构建了分泌人胰岛素原(PINS)和IL-10的重组乳球菌，给新发病的糖尿病小鼠口服重组乳球菌并给予亚治疗剂量的抗CD3抗体，结果表明，66%的小鼠在治疗后恢复正常血糖，该效果显著优于仅用抗CD3治疗的的小鼠(43%)，而单纯口服重组乳球菌的实验组则为17%，其中对照组小鼠为0%。总之，使用重组乳球菌菌株是治疗自身免疫性疾病的潜在有效策略，但仍需行进一步的研究。

2.4 癌症

癌症是威胁人类健康的一大杀手，严重影响人类生活质量。癌症的进展与慢性炎症有关；因此，用于治疗癌症的重组LAB主要旨在减少炎症的进展。活性氧物质例如过氧化氢，参与结肠癌(colorectal cancer，CRC)发展的各个方面。降低它们的水平可能是预防结肠癌的一种有效方法，Alejandra等人[36]进行一项研究，目的是评估分泌过氧化氢酶的重组乳球菌对预防实验性小鼠1,2-二甲基肼诱导的结肠癌的影响，结果发现口服重组菌能够增加实验小鼠体内的过氧化氢酶活性，从而减少结肠炎症和损伤。Tina等人[37]构建了表达癌症相关上皮细胞黏附分子(EpCAM)和人表皮生长因子受体2(HER2)融合蛋白的重组乳球菌，并在体外证实了重组乳球菌黏附在具有过度表达肿瘤抗原的HEK293细胞，另一方面，没有观察到该重组菌与没有肿瘤抗原表达的HEK293细胞结合，证实了工程化乳球菌的选择性。Carmen等人[38]构建了表达抗氧化酶(过氧化氢酶或超氧化物歧化酶)或IL-10的重组LAB，并通过体内实验证明，口服重组菌的结肠癌模型小鼠显示出较少的微观肠道损伤，说明该辅助治疗可用于缓解与结直肠癌相关的炎症环境。E.Bohlul等人[39]构建了表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白的重组乳球菌。研究表明，产生TRAIL蛋白的重组乳酸球菌可诱导人结肠癌细胞系SW480和HCT116细胞凋亡。且Kaczmarek等人[40]后续研究发现，口服二甲双胍进一步增强了重组乳球菌分泌TRAIL的这种体内抗肿瘤活性。另一方面，针对宫颈癌，Li等人[41]构建了携带人乳头瘤病毒E7蛋白和IL-12 DNA的乳球菌，通过鼻内给药的方式，发现在注射了表达E7的肿瘤细胞系(TC-1)的小鼠中，实验组比对照组肿瘤生长明显受抑制，说明重组菌能够有效引发抗原特异性免疫反应。Kawana等人[42-44]通过口服分泌突变的HPV16 E7蛋白的重组乳酸杆菌进行了为期8周的观察性1/2a期临床试验，结果表明，口服分泌HPV16 E7重组菌可增加血清HPV16 E7特异性抗体的产生，从而诱导保护性体液免疫，并且该免疫方式是安全的。Mohseni等人[45]则构建了分泌突变的HPV16 E7蛋白的乳球菌，并且证明了口服重组菌的C57BL/6小鼠体内，抗原刺激的脾细胞和肠黏膜淋巴细胞中分泌HPV-16 E7特异性IL-2和IFN-γ的T细胞显著高于对照组，说明接种重组菌的小鼠能够对TC-1细胞的攻击产生有效的保护作用。Sedigheh等人[46]构建了分泌突变的HPV16 E6蛋白的乳球菌，实验证明，乳球菌展示的E6蛋白可以诱导体液和细胞免疫，对肿瘤大小进展具有一定抑制作用。

2.5 其他疾病

近年来，也有研究者尝试用重组LAB作为药物分子的投递载体防治2型糖尿病。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种由肠细胞产生的肠促胰岛素，以葡萄糖依赖性方式刺激胰腺分泌胰岛素，外源供应的GLP-1类似物用于治疗2型糖尿病。Agarwal等人[47]构建了表达 GLP-1的重组乳球菌，该重组菌灌胃大鼠后的2～11 h，大鼠的胰岛素水平显著增加，血糖水平显著降低，表明重组的乳球菌表达出了具有功能活性的GLP-1。Exendin-4是一种GLP-1受体激动剂，Zeng等[48]使用了重组乳球菌载体表达Exendin-4，研究发现重组乳球菌能够显著促进胰岛β细胞INS-1分泌胰岛素和促进胰岛细胞增殖。此外，Kaja等人[49]运用重组乳球菌治疗多发性硬化症，他们构建了产生髓鞘肽的重组乳球菌，通过口服给药过敏性脑脊髓炎模型大鼠，结果发现实验组大鼠血清IL-1b、IL-10和TNF-α的水平明显降低。Guilherme等人[50]构建了分泌Hsp65的重组乳球菌，Hsp65在炎症组织中过度表达，能够诱导免疫调节机制，实验结果发现，用产Hsp65的乳球菌口服治疗可防止模型小鼠关节炎的发展。这种效应与通过喂食Hsp65在肠道中触发的耐受机制有关。

3 总结

LAB表达系统的发展促进了旨在确定表达抗原(细胞质、分泌或细胞壁锚定)的细胞定位以及定位对其免疫原能力的影响的研究。在表面表达抗原的LAB可能比那些表达细胞质抗原的LAB表现出更显著的免疫学效应，因为细胞表面抗原具有直接与环境相互作用并避免蛋白水解降解的能力。在某些情况下，由于避免暴露于恶劣的环境条件，细胞内抗原比在其他位置表达的抗原更具免疫原性[1, 51]。在给药方式上，不同的黏膜给药途径引起不同的免疫作用。大多数研究表明鼻内给药比胃内途径能更有效地诱导全身反应，灭活的重组LAB更适合鼻内接种[52-53]。胃内免疫则更方便、经济，更适用于动物饲料业务。尽管重组LAB应用前景广阔，仍存在安全性、稳定性、持久性等问题亟待解决。为了改进使用LAB作为载体的疗法设计，未来应解决以下问题：①不同治疗分子在重组LAB中的共表达；②选择持久性LAB物种，尤其是乳酸杆菌属；③开发合适的黏膜递送系统，包括理想的抗原递送系统和特定佐剂；④高效表达系统的设计。在不久的将来，更多的研究和临床试验将促进重组LAB作为一种新的治疗方法来预防和治疗各种人类疾病。