DNA 鉴定工作中的特殊STR 分型

李甫，肖东，侯银玲，王鹏，金海英，王礼斌，罗祥敏，郑行恺

1.北京市公安局东城分局，北京 100005；2.徐州市公安局刑警支队，江苏 徐州 221000；3.宁波海尔施基因科技股份有限公司，浙江 宁波 315040

DNA 数据库是将分子遗传学技术、计算机网络技术和数据库管理技术相结合，实现DNA 信息数字化存储、管理和检索的系统[1]。STR 由于具有良好的多态性，现已成为法庭科学实践中所使用的重要遗传标记[2]。常染色体STR 基因座是目前亲权鉴定和个体识别中运用最广泛的遗传标记，性染色体STR 基因座以其独特的遗传特点在个体识别、亲子鉴定、血缘关系鉴定及族谱DNA 分析等方面具有十分重要的研究和应用价值[3]。目前已有多种应用于法医检测的商品化STR 分型试剂盒，极大地推动了STR 在侦查破案和司法审判中的科学应用。

由于生物样本的复杂性和特殊性，样本中特殊STR 分型为DNA 数据库建设工作带来一定的困难。本研究针对实验室日常检测工作中积累的具有代表性的样本进行数据整理，以期为DNA 身份鉴定工作中特殊STR 分型的判断提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究对3 例出现特殊STR 分型的案例进行检测分析，其样本均为以血卡形式保存的血液，编号分别 为Sample-517（案 例1）、Sample-47（案 例2）和Sample-103（案例3）。使用孔径1.0 mm 打孔器取样获得直接扩增模板。

1.1.1 案例1

使用SureID®PanGlobal 人类DNA 身份鉴定试剂盒（宁波海尔施基因科技股份有限公司，简称SureID®PanGlobal 试剂盒）对Sample-517 进行扩增检测时发现，其Amelogenin基因座分型结果为“X，Y”，可判断该样本为男性，而其Y-STR 基因座（DYS391）和YInDel 均表现为无效扩增，使用GlobalFilerTMPCR 扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司，简称GlobalFilerTM试剂盒）对该样本进行复检，分型结果与SureID®PanGlobal 试剂盒一致。不同基因座对样本性别的判断不一致，故分别使用SureID®PathFinder Plus 扩增荧光检测试剂盒（宁波海尔施基因科技股份有限公司，简称SureID®PathFinder Plus 试剂盒）和YFiler Platinum PCR 扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司，简称YFiler Platinum 试剂盒）针对该样本的Y-STR 开展检测，旨在通过Y-STR 分型检测结果判断其性别。

1.1.2 案例2

使用SureID®Y35 扩增荧光检测试剂盒（宁波海尔施基因科技股份有限公司，简称SureID®Y35 试剂盒）对Sample-47 进行扩增检测时发现，其DYS481基因座分型结果为“24”，使用YFiler Platinum 试剂盒对该样本进行复检，DYS481基因座分型结果为“24.2”，选择PowerPlex®Y23 系统（美国Promega 公司）对该样本再次进行复检，DYS481基因座分型结果为“24”。3 款试剂盒在该基因座分型结果不一致，故对差异片段进行克隆测序分析，旨在通过测序结果明确该样本在DYS481基因座的正确分型。

1.1.3 案例3

使用SureID®PanGlobal 试剂盒对Sample-103 进行扩增，发现D7S820和D19S433这两个相邻基因座的分型结果分别为“8”和“12”，但在两个基因座之间还存在一个峰，且无法判断该中间峰属于哪个基因座。使用GlobalFilerTM试剂盒对该样本进行复检，结果显示，D7S820和D19S433基因座的分型结果分别为“8”和“12”，而与D19S433相邻的D2S441基因座则出现三等位基因，分型结果为“10/13/OL”，反观SureID®PanGlobal 试剂盒的扩增结果中D2S441基因座分型为“10/13”。根据以上结果，初步推断该样本在D19S433基因座出现了稀有等位基因[4]，故使用SureID®Pan-Global 试剂盒中仅扩增D19S433基因座的引物组对该样本进行扩增，旨在利用该引物组的扩增结果明确其分型。

1.2 检测方法

检测方法参考相应试剂盒说明书，均采用10 μL扩增体系在9700 型PCR 仪（美国Applied Biosystems公司）上进行扩增。扩增产物均在3500xL 基因分析仪（美国Applied Biosystems 公司）上进行电泳检测。电泳数据均使用GeneMapperTMID-X软件（美国Thermo Fisher Scientific 公司）进行分析。

2 结果

2.1 多个基因座缺失样本（Sample-517）

图1A 和图1B 分别为SureID®PanGlobal 试剂盒和GlobalFilerTM试剂盒对Sample-517 中DYS391、YInDel 的检测结果，图1C 和图1D 分别为SureID®Path-Finder Plus 和YFiler Platinum 试剂盒的检测结果，根据图谱信息可判断该样本部分Y-STR 呈现缺失状态。

图1 Sample-517 检测结果中基因座缺失情况Fig.1 Loci deletion in the test results of Sample-517

为了明确该样本缺失基因座在Y 染色体上的大致位置，将Y-STR 的位置排布进行了整理（图2），发现该样本的Y-STR 缺失范围集中在Y 染色体长臂上的Yq11.21-Yq11.23 区域。

图2 Y-STR 基因座结构示意图Fig.2 Structure diagram of Y-STR loci

2.2 试剂盒分型不一致样本（Sample-47）

使用YFiler Platinum 试剂盒、SureID®Y35 试剂盒和PowerPlex®Y23 系统3 款试剂盒分别对Sample-47 进行检验后发现，在DYS481基因座上出现分型不一致现象（图3）。YFiler Platinum 试剂盒在DYS481基因座的分型结果为“24.2”，而SureID®Y35 试剂盒和PowerPlex®Y23 系统的分型结果为“24”。

图3 Sample-47 使用不同试剂盒的分型结果Fig.3 Typing results of Sample-47 using different kits

对差异片段克隆测序后进行分析，Sample-47 的测序结果（图4）显示，基因座核心序列（CTT）的重复数为“24”，但核心序列之外产生了2 个碱基（GT）的插入突变。由于YFiler Platinum 试剂盒在此基因座设计的引物位于插入突变的左侧，扩增范围包含突变部分，故使获得的扩增片段长度增加，经GeneMapperTMIDX软件分析时，将基因分型误判为“24.2”。而SureID®Y35 试剂盒和PowerPlex®Y23 系统在此基因座设计的引物位于插入突变的右侧，扩增范围不包含此突变，因此得到的分型结果为“24”。

图4 Sample-47 扩增产物测序比对结果Fig.4 Comparison results of amplification product sequencing of Sample-47

2.3 稀有等位基因样本（Sample-103）

图5A 和图5B 分别为SureID®PanGlobal 试剂盒、GlobalFilerTM试剂盒对Sample-103 的检测结果，图5C为SureID®PanGlobal 试剂盒中扩增D19S433基因座的引物组对Sample-103 的检测结果。

由图5 可知，使用SureID®PanGlobal 试 剂盒和GlobalFilerTM试剂盒对样本Sample-103 进行扩增时，均在D19S433基因座范围外出现分型。由此判断D19S433基因座出现稀有等位基因。之后进一步使用SureID®PanGlobal 试剂盒D19S433基因座的引物组进行扩增，可确认D19S433基因座的分型结果为“4/12”。

图5 Sample-103 使用不同试剂盒的分型结果Fig.5 Typing results of Sample-103 using different kits

3 讨论

3.1 多个基因座缺失

Y-STR 存在于Y 染色体的非重组区，而该区域具有结构不稳定的特性，易发生Y 染色体内部的重组，致使Y 染色体出现重复、倒置、缺失等结构重排现象[5]。STR 分型检测中，等位基因漏检可由多种原因引起，如模板降解、存在抑制物以及引物结合区点突变等[6]，本文案例1 中结合图谱表现可排除以上原因，Sample-517 的Y-STR 基因座无效扩增即由Y 染色体缺失引起。结合参考文献[7-8]发现，近年来Y-STR 缺失的案例报道逐渐增加。在样本基数庞大的DNA 数据库建设工作中，基因座缺失类样本往往容易被忽视以致未导入DNA 数据库中，实际上，多个基因座缺失的样本在人群中相对稀有，对于家系排查工作更能提供帮助信息。

在该案例的后续分析中，研究人员将利用Y 染色体微缺失检测试剂盒对该样本进行验证，进一步明确Y 染色体缺失区域，并拟通过重设大片段引物对缺失区域进行扩增，以明确Yq11.21-Yq11.23 区域是大片段缺失还是部分缺失，并找到发生突变缺失的序列。

3.2 试剂盒分型不一致

侧翼序列突变引起的STR 分型错判及试剂盒间的分型差异近年来已逐渐受到重视，李斌[9]于2015 年使用8 种STR 检测试剂盒对2 203 份血液样本进行检测分析，发现5 例样本存在该现象；傅燕芳等[10]于2017 年使用2 种STR 检测试剂盒进行检测分析，发现2 例样本存在该现象。除本文展示的侧翼序列突变外，常见的突变还包含核心重复区域内部的突变和PCR 引物结合区的突变，当突变发生在PCR 引物结合区，会使引物无法与DNA 片段良好结合，PCR 过程中延伸受到阻碍，致使扩增失败[11]。

理论上讲，此类样本不使用不同试剂盒是难以被发现的，本案例是在工作中使用YFiler Platinum 试剂盒对SureID®Y35 试剂盒的检测结果进行复检时发现。这种分型差异现象在家系比对工作中或将对刑侦方向造成影响。因此，在设计试剂盒的基因座引物时，如果能保持一致可以减少此类问题的发生，以达到分型结果准确一致，这或是公安信息化和公安科技发展中值得思考的问题。

3.3 稀有等位基因

判读超出基因座ladder 范围的稀有等位基因分型结果，首先必须确定该稀有等位基因的来源基因座[12]。实际工作中，实验人员若不能直接进行准确分型判断，可采用其他试剂盒进行复核验证，必要时还可进行单基因座扩增验证后测序[13]。

在DNA 数据库建设过程中，稀有等位基因的出现是很难避免的。目前的STR-CE 技术及配套的分析软件很难做到规避稀有等位基因造成的影响，其原因是商品化试剂盒设计的适应常规样本的panel 和bin 并不能涵盖稀有等位基因，但盲目追求更大的涵盖范围会适得其反，使试剂盒的检测效率降低。随着DNA 检测技术的不断发展，部分厂商根据已有的人群调查的等位基因记录，立足于中国人群的特殊性，对检测试剂盒panel 和bin 的涵盖范围有针对性地进行改进和优化或许是解决稀有等位基因引起STR 分型错判的方案之一。

4 总结

尽可能快地发现错误并确定错误原因，尽可能多地控制和排除错误，评估物证鉴定结论的错误风险，是物证鉴定工作中的关键任务[14]。本研究通过对DNA身份鉴定工作中多个基因座缺失、STR 位点侧翼序列突变和稀有等位基因典型案例的报道，引出DNA 数据库建设和DNA 数据比对过程中可能出现的问题，提出合理化建议，期望减少特殊样本对DNA 数据库建设和应用造成的影响。具体建议如下：（1）DNA 数据库建设过程中尽量使用同种试剂盒；（2）DNA 分型比对中无法准确比中时，可适当调整为相对宽松的比对原则；（3）试剂盒设计时适当增加基因座数目，基因座的选择及panel 和bin 的设计可根据中国人群数据进行扩充；（4）必要时可使用其他试剂盒进行比对验证；（5）注重培养法庭科学从业人员严谨的工作态度，提升对特殊案例的判断能力。