基于大鼠心肌组织mRNA 表达谱筛选冠状动脉性猝死相关生物标志物

郭相杰，李昊，白雅琴，吴鹏，赵春梅，董祎铭，陈念念，贠克明，高彩荣

山西医科大学法医学院，山西 晋中 030600

冠状动脉性猝死（sudden coronary death，SCD）是指由于冠状动脉异常导致的心脏性猝死[1]，是心脏性猝死中最常见的一种。绝大多数SCD 由冠状动脉粥样硬化引起管腔狭窄或血栓栓塞导致，少数由于冠状动脉痉挛引起血管壁严重收缩使管腔阻塞所致[2]。SCD 起病急骤，常在几分钟至数小时内死亡，形态学改变轻微或缺如，是法医学鉴定和研究的难点。转录组学可以提供特定条件下基因表达的信息，近年来已被广泛应用于法医学领域，可用于死亡原因分析和死亡时间推断[2]。信使RNA（messenger RNA，mRNA）作为DNA 与蛋白质之间生物信息传递的枢纽，起着决定细胞表型的作用，具有组织特异性[2-3]。mRNA 的合成转录过程是基因表达的第一步，也是基因表达调控的关键环节。而且mRNA 对于疾病状态十分敏感，其变化通常早于组织水平和蛋白水平，较以往的生物化学指标和炎症因子而言，其敏感性和特异性更强[3]，有望作为SCD 的法医学诊断生物标志物。

因此，本研究拟建立SCD 大鼠模型，运用二代测序平台和生物信息分析等方法，重点研究SCD 大鼠早期基因转录表达变化，鉴定心肌损伤后早期的差异表达基因（differentially expressed gene，DEG），并对其进行生物学功能和信号通路富集分析，根据DEG 构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，运用拓扑算法分析筛选出具有潜在法医学意义的基因，以期为SCD 的法医学鉴定提供生物标志物。

1 材料与方法

1.1 大鼠模型制备

SPF 级雄性SD 大鼠24 只，6～8 周龄，体质量（200±20）g。适应性喂养1 周后，随机分为动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）、动脉粥样硬化死亡（atherosclerotic death，ASD）、急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）和假手术组，每组6 只大鼠。AS 组和ASD 组经高脂饮食喂养形成冠状动脉粥样硬化，AMI组和假手术组正常饮食喂养。本实验经山西医科大学科学研究伦理审查委员会批准（审批文号：2021LL244）。

1.1.1 AS 组

通过高脂乳剂灌胃联合腹腔注射维生素D3 建立冠状动脉粥样硬化模型[4]。实验开始前一次性腹腔注射维生素D3（美国Sigma-Aldrich 公司）600 000 IU/kg，第3、6、9 周分别腹腔注射维生素D3 100 000 IU/kg。将25 g 猪油加热至100 ℃，加入5 g 胆固醇［生工生物工程（上海）股份有限公司］、5 g 白砂糖、5 g 蛋黄粉、1 g丙基硫氧嘧啶（北京索莱宝科技有限公司）和25 mL吐温-80（大连美仑生物技术有限公司），搅拌均匀，制成油相；30 mL 蒸馏水中加入2 g 脱氧胆酸钠，搅拌溶解后制成水相；将水相和油相搅拌混匀即成高脂乳剂。将高脂乳剂置于密闭容器中4 ℃冷藏，使用时37 ℃水浴融化，1 mL/100 g 灌胃，2 次/d，共12 周。

12 周后，使用AU5800 全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter 公司）检测大鼠血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），计算动脉粥样硬化指数（atherosclerosis index，AI）判断模型是否成功，AI=（TC-HDL）/HDL。AI 大于3.8 提示发生冠状动脉粥样硬化[4]。其余各组大鼠在喂养12 周后均进行上述指标的检测。

1.1.2 ASD 组

同1.1.1 节方法制备大鼠冠状动脉粥样硬化模型后，使用异氟烷（浓度2%～3%，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）麻醉大鼠，将其固定在手术台上，经口气管插管并连接HX-300S 动物呼吸机（成都泰盟软件有限公司），通气频率70 次/min，潮气量0.8～1 mL，呼吸比2∶1。四肢连接BL-420S 生物机能实验系统（成都泰盟软件有限公司）记录术前心电图。于第3～4 肋间切开心脏搏动最强处皮肤，钝性分离肌层组织，剥离心包暴露心脏，用6-0 缝线在左心耳根部下方3～5 mm处连同少量心肌组织结扎冠状动脉左前降支[5]。记录术后心电图，4 只大鼠在术后15～20 min 死亡，2 只大鼠在术后30 min 生命体征微弱，脱颈处死。

1.1.3 AMI 组

健康大鼠直接采用1.1.2 节方法建立急性心肌缺血死亡模型，大鼠均在术后30 min 内死亡。

1.1.4 假手术组

同1.1.2 节方法开胸暴露心脏，用6-0 缝线在左心耳根部下方穿过心肌组织，但不结扎冠状动脉，术后30 min 脱颈处死大鼠。

1.2 检材提取与制备

每组取3 只大鼠，使用无菌手术器械提取大鼠左心室心肌约100 mg，立即置于液氮中冷冻，随即-80 ℃保存，用于RNA 测序分析。每组剩余3 只大鼠取完整心脏置于4%多聚甲醛溶液中固定，常温保存，用于苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和组织学观察。

1.3 RNA 提取与检测

用TRIzol 试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司）提取心肌组织中RNA，使用NanoDrop 2000 超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific 公司）检测总RNA 纯度与浓度，使用2100 生物分析仪（美国Agilent 公司）测量RNA 的完整性，选取D260/D280值为1.8～2.2、RNA 完整性指数（RNA integrity number，RIN）值大于7.0 的RNA 样本[6]，用于后续实验。

1.4 文库构建与测序

RNA 质检合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集样本的mRNA，然后加入Fragmentation Buffer 随机打断mRNA；以mRNA 为模板反转录得到互补DNA（complementary DNA，cDNA），并对cDNA 进行纯化、末端修复、加A 尾、连接测序接头，选择片段大小；通过PCR 富集获得cDNA 文库。使用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，q-PCR）方法定量文库有效浓度（浓度应大于2 nmol/L）。不同文库根据目标下机数据量进行pooling，用NovaSeq 6000 测序系统（美国Illumina 公司）进行测序。

1.5 数据预处理

得到原始数据后，使用Qsep400 高通量生物片段分析仪［光鼎生物科技（江苏）有限公司］去除含接头、低质量的序列（N 的比例大于10%，质量值Q≤10 的碱基数大于50%）。测序质量标准为Q30，即每个碱基的准确度为99.9%。用HISAT2 软件（https://daehwan kimlab.github.io/hisat2/）比对大鼠参考基因组进一步分析和注释。用每百万测序碱基中基因外显子每千个碱基长度中所包含的测序片段数（fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，FPKM）值表示基因表达水平，得到用于后续分析的基因表达量数据。

1.6 生物信息分析

1.6.1 筛选不同组间DEG

本研究将基因差异分析分为3 组，即假手术组-AMI 组、假手术组-AS 组、AS 组-ASD 组。数据经预处理后，在R 4.0.4 软件中使用limma 包进行差异表达分析，设定阈值为差异倍数（fold change，FC）上调或下调2 倍（|log2FC|＞1）且P＜0.05。使用R 软件ggplot2包绘制不同组间DEG 的火山图。将3 组结果所得的差异基因取交集，绘制DEG 的韦恩图。

1.6.2 对不同组间DEG 进行富集分析

基因本体论（gene ontology，GO）富集包括生物过程、分子功能和细胞组分3 个层面；京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）能依据分子水平信息了解生物系统以及高级功能。为了探寻不同DEG 的功能和信号通路，利用R软 件clusterProfiler、org.Mm.eg.db、enrichplot、ggplot2包对不同组间DEG 分别进行GO 和KEGG 富集分析。

1.6.3 构建不同组间PPI 网络并筛选关键基因

STRING 是依据各种来源信息分析蛋白质相互作用的数据库，包括已知关系和未知的预测关系。将筛选出的DEG导入STRING数据库，将最小互作评分≥0.4的蛋白质构建PPI网络图，并使用Cytoscape 3.8.2软件（https://cytoscape.org/）中的cytoHubba 插件对PPI 网络进行分析，用Degree 拓扑算法分析筛选排在前10 位的hub 基因，绘制共表达及互作网络图。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 大鼠模型的建立

2.1.1 血脂浓度的变化

大鼠血清中TC、TG、LDL、HDL浓度见表1。高脂喂养大鼠与正常饮食大鼠相比，TC和LDL升高，HDL降低。高脂喂养大鼠AI＞3.8，较正常饮食大鼠升高（P＜0.05），说明AS 组和ASD 组大鼠发生冠状动脉粥样硬化。

表1 大鼠血脂浓度Tab.1 Blood lipid levels in rat models （n=12，）

表1 大鼠血脂浓度Tab.1 Blood lipid levels in rat models （n=12，）

注：高脂喂养包括AS 组和ASD 组，正常饮食包括AMI组和假手术组。1）与正常饮食大鼠相比，P<0.05。

2.1.2 冠状动脉的组织病理学改变

各组大鼠冠状动脉和心肌的组织病理学改变见图1。假手术组冠状动脉及心肌未见异常；AS 组和ASD 组冠状动脉左前降支血管内皮细胞排列紊乱，内膜增厚，管腔狭窄，血管周围有炎症细胞浸润；AS 组个别心肌细胞嗜伊红染色增强，心肌间质内可见小灶性炎症细胞浸润；AMI 组和ASD 组出现心肌细胞变性、结构不清，并可见收缩带坏死、小灶性出血、心肌间质炎症细胞浸润。说明AS 组、ASD 组大鼠发生了冠状动脉粥样硬化，AMI 组、ASD 组大鼠发生了急性心肌梗死。

图1 各组大鼠冠状动脉和心肌的组织病理学改变（HE×400）Fig.1 Histopathologic changes of coronary artery and myocardium of rats in each group（HE×400）

2.1.3 心电图改变

各组大鼠的心电图结果见图2。假手术组和AS组心电图节律平稳正常，AMI 组和ASD 组心率降低，出现病理性Q 波，ST 段抬高且T 波高耸，提示出现急性ST 段抬高型心肌梗死改变。

图2 各组大鼠的心电图Fig.2 Electrocardiograms of rats in each group

2.2 RNA 测序结果与数据处理

所有样本RNA 的D260/D280值均在1.8～2.2，RIN 值均大于7，符合标准，可进入建库测序程序。

使用NovaSeq 6000 测序系统进行转录组测序，并对原始测序数据进行过滤，得到质控后的原始测序数据用于后续分析，对cDNA 文库测序得到原始数据。对质量修剪后的序列进行统计，Q30 碱基所占百分比≥93.52%（表2）。

表2 大鼠心肌组织测序数据统计结果Tab.2 Statistical results of rat myocardial tissue sequencing data

2.3 基因差异表达分析

通过R软件limma包共筛选出1 074个DEG。AMI组、AS 组与假手术组相比，ASD 组与AS 组相比，DEG数目及表达的上调或下调结果如表3 所示，根据DEG的分布绘制的火山图见图3。

表3 不同组间DEG 的数目Tab.3 Number of DEG between different groups（个）

图3 不同组间DEG 的表达变化Fig.3 Changes of DEG expression in different groups

将3 组结果所得的差异基因取交集（图4），因获得的共同差异基因不具备组间特异性，故将其去除；假手术组-AMI 组与AS 组-ASD 组的共同基因可能参与急性心肌缺血的发生，故予以保留。最终得到177个与SCD 相关的基因，其中130 个为ASD 特异性基因，44 个为AMI 特异性基因。另有725 个基因与冠状动脉粥样硬化相关。

图4 不同组间DEG 的韦恩图Fig.4 Venn diagram of DEG between different groups

2.4 差异基因的GO 富集结果

不同组间差异基因的GO 富集结果见图5。

假手术组-AMI 组富集到的生物学功能包括趋化性调节、横纹肌组织发育、细胞生长调节等；分子功能涉及受体配体活性、信号受体激活剂活性、生长因子活性等；细胞组分有突触膜、运输囊泡膜、外动力蛋白臂等（图5A）。

假手术组-AS 组富集到的生物学功能包括细胞-基质黏附、肌肉组织发育、血管发育的调节等；分子功能涉及细胞外基质结构成分、内肽酶活性、微管蛋白结合等；细胞组分有含胶原细胞外基质、主轴、染色体区域等（图5B）。

AS组-ASD 组富集到的生物学功能包括细胞黏附的正向调节、膜电位调节、淋巴细胞分化等；分子功能涉及肽结合、酰胺结合、金属离子跨膜转运蛋白活性等；细胞组分包括远端轴突、转录调节复合物等（图5C）。

图5 不同组间差异基因的GO 富集结果Fig.5 GO enrichment results of differential genes between different groups

2.5 差异基因的KEGG 富集结果

不同组间差异基因的KEGG 富集结果见图6。

假手术组-AMI 组差异基因主要参与轴突引导、细胞因子-细胞因子受体相互作用、肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）等与急性心肌缺血相关的信号通路（图6A）。

假手术组-AS组差异基因主要参与磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、松弛素信号通路等与冠心病发生发展相关的信号通路（图6B）。

AS 组-ASD 组差异基因主要参与PI3K-Akt 信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等与SCD 相关的信号通路（图6C）。

图6 不同组间差异基因的KEGG 富集结果Fig.6 KEGG enrichment results of differential genes between different groups

2.6 PPI 网络和关键基因

基于PPI 网络，使用cytoHubba 插件中的Degree拓扑算法分析筛选出不同组间排名前10 位的DEG，得到各组关键基因的共表达及互作网络（图7）。基因之间的连线代表基因的相互作用关系，基因的Degree值越大，其颜色越深，在网络中发挥的作用越重要。

AMI 组与假手术组相比得到两个较为重要的互作网络，分别是血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）、补体成分4a（C4a）、补体因子D（complement factor D，CFD）、补体C6（complement C6，C6）组成的网络和S100 钙结合蛋白B（S100 calcium-binding protein B，S100B）、脱中胚蛋白（eomesodermin，EOMES）、溶质载体家族1 成员3（solute carrier family 1 member 3，SLC1A3）组成的网络（图7A）。这7 个基因在AMI 中发挥着关键作用。

ASD 组与AS 组相比得到的Fos 原癌基因（Fos proto-oncogene，FOS）、CC 趋化因子配体2（CC chemokine ligand 2，CCL2）、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基1（phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit 1，PI3KR1）等关键基因（图7B），与AS 组和假手术组相比得到的关键基因（图7C）不同，说明FOS、CCL2、PI3KR1等基因在猝死时发挥关键作用。

图7 不同组间排名前10 位hub 基因的共表达及互作网络Fig.7 Co-expression and interaction network of the top 10 hub genes among each group

3 讨论

SCD 是心脏性猝死中最主要也是最常见的类型。SCD 死亡过程较短，缺乏特异的病理学及形态学改变，虽有可能观察到冠状动脉粥样硬化，但其狭窄程度可能较轻微，无法依此判断是否发生SCD，缺乏直接证据。目前，国内外学者主要通过急性心肌缺血模型进行心脏性猝死的研究[5]，但该模型无法模拟实践中存在的冠状动脉粥样硬化而猝死的情况，仍有一定的局限性。本研究就SCD 的两种情况（即冠状动脉粥样硬化和冠状动脉痉挛）分别建立动物模型，通过结扎冠状动脉左前降支模拟两种病变共同的猝死机制，即冠状动脉血流突然中断，导致心肌急性缺血、心电紊乱而死亡，最大程度上模拟法医学实践中的SCD。通过比较各组心肌组织转录组学数据得到DEG，进行生物信息分析，寻找SCD 发生过程中的关键基因，探索基因表达变化，以期为SCD 的法医学诊断提供潜在分子标志物。

通过对假手术组和AMI 组的大鼠基因数据进行比较，共确定了44 个DEG 为AMI 特异性基因（图4）。这些基因参与调控的RAS 是经典的调节心血管稳态的系统，AMI 后心肌RAS 激活，促进炎症、心肌增殖和纤维化，促进氧化低密度脂蛋白摄取，并抑制纤维蛋白溶解、损伤血管内皮，从而加速心肌损伤[7]。在筛选到的关键基因中，AGT基因编码的血管紧张素原是RAS 中的一种限制性底物，可限制血管紧张素Ⅱ的生成，从而参与血管收缩、血管平滑肌细胞生长、血栓形成和抗纤维蛋白溶解等多种机制，调节缺血后的心肌和血管损伤[8]。与AGT相互作用的C4a、CFD、C6为编码补体成分的基因，C4和CFD基因编码的补体因子D可参与形成C3 转化酶，促进C3 表达增加；而C6 参与补体激活末端通路中攻膜复合物形成，导致细胞溶解和炎症因子释放。研究[9]发现，心肌损伤时坏死和凋亡细胞增加，可导致补体途径激活，C3 表达增加，而C4消耗过多甚至耗竭，导致血清C3 与C4 比值（C3/C4）升高，可作为急性冠状动脉综合征的新型标志物；有文献[10]指出AMI患者血浆中CFD 和C6表达显著上调，说明补体系统激活在SCD 中发挥关键作用。S100B的高水平表达不仅与急性心脏性死亡有关，在创伤性脑损伤、机械性窒息等死因中同样增高[11]。因此，S100B 在SCD 中的应用价值仍需进一步验证。此外，与S100B 相互作用的EOMES[12]和SLC1A3[13]与心肌缺血损伤有关，但相关研究较少，仍有待进一步探讨。

与AS 相关的关键基因共表达及互作网络（图7C）中，10 个基因均与细胞周期调控相关，主要参与血管平滑肌的增殖和修复。通过对AS 组和ASD 组基因数据进行比较共确定了130 个猝死特异性DEG。在筛选到的基因中，FOS是SCD 最关键的基因，其在正常情况下很少表达或几乎不表达，但可因严重的心肌缺血或缺血再灌注导致异常高表达，对于猝死时程短于30 min 的案例，检测FOS基因表达有一定的参考意义[14]。CCL2 是介导单核细胞聚集的炎症趋化因子，可与趋化因子受体相互作用激活磷脂酶C 和PI3K通路，诱导定向细胞迁移至损伤部位参与心肌损伤、修复和重塑[15]。PI3KR1 在Akt 磷酸化中至关重要，通过编码PI3K 的调节亚基p85α 发挥作用[16]。已有研究[17-18]证实，PI3KR1可通过PI3K-Akt信号通路下游的FoxO3a 通路和mTORC1 通路（或p53 通路）参与心肌细胞焦亡、炎症因子释放以及心肌纤维化、细胞凋亡和功能障碍。电压门控钙通道亚基alpha1 A（voltagegated calcium channel subunit alpha1 A，CACNA1A）是电压依赖性钙通道亚基，介导钙离子内流兴奋细胞。CACNA1A 的同种型CACNA1C 在PI3K-Akt 信号通路下游发挥作用，调控心脏电生理活动，在室性心律失常和心脏性猝死中起重要作用[15]。激活转录因子3（activating transcription factor 3，ATF3）与冠状动脉内膜厚度、坏死核心厚度和管腔狭窄呈负相关，可能通过调节炎症反应影响动脉粥样硬化斑块的结构稳定性[19]。核受体亚家族4A 组成员1（nuclear receptor subfamily 4 group A member 1，NR4A1）是血管内皮细胞炎症，血管生成、增殖和凋亡的关键调节因子，可以通过PI3K-Akt-FAK 信号通路促进血管生成[20]，或抑制PI3K-Akt 下游核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路改善心肌纤维化[21]。髓样细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cell 2，TREM2）是巨噬细胞的关键调节因子，可能通过激活PI3K-Akt 信号通路抑制心肌缺血损伤，并可反映冠状动脉狭窄的严重程度[22]。由此可见，冠状动脉粥样硬化和SCD 都有PI3K-Akt 信号通路的参与，但病情稳定时该通路并不激活，发生猝死时下游信号通路中的基因CCL2、PI3KR1、CACNA1A、NR4A1、TREM2等激活，参与心肌缺血、心电紊乱等病理过程导致死亡。

此外，S100B、肌球蛋白轻链7（myosin light chain 7，MYL7）、锌指蛋白169（zinc finger protein 169，ZFP169）是AS和ASD的共同DEG。研究[11]发现，S100B与急性心脏性死亡之间存在相关性，但脑损伤、机械性窒息等原因亦会导致死亡后S100B 高水平表达。因此，S100B 是否可作为SCD 的生物标志物，有待进一步探究。MYL7 参与肌动蛋白细胞骨架合成、白细胞跨内皮迁移等信号通路。研究[23]表明，MYL7 调节心脏发育和心肌收缩，其表达下调可能导致心脏发育受损和心肌结构受损，其也可作为SCD 的潜在标志物。而关于ZFP169基因与SCD 的关系仍需进一步研究。在既往的心脏性猝死相关法医学研究中，脑利尿钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和c-fos 的研究最为广泛，临床上也将BNP 作为心肌梗死的诊断指标。但在本研究中，各组大鼠心肌的转录组学数据并未显示BNP 的差异表达。研究[24]发现，BNP基因的表达水平在AMI 发生1 h 内并无显著差异，说明BNP并非能够反映AMI 极早期变化的最佳基因。而本研究中的AGT、C4a、CFD、C6等基因或可成为SCD 的早期诊断标志物，但由于本研究尚缺乏人体样本的检测数据，需要进一步在实践中收集人体样本进行验证。此外，本研究发现FOS是SCD 的最关键基因，与以往研究[14]结果一致，但CCL2、PI3KR1、CACNA1A等基因仍需在人体样本中进一步验证。

此外，mRNA 在死后容易发生降解，虽有研究[25]证实心脏中mRNA 可在死后3 d 内保持稳定，但在法医学实践中，受各种环境因素的影响，可加速mRNA的降解，应注意尸体保存条件，及早取材，日后也应对上述mRNA 的死后降解规律行进一步的探索研究。

综上所述，本研究成功建立了SCD 大鼠模型；基于二代测序平台对模型心肌进行基因转录表达谱测序，利用生物信息学方法分析DEG，筛选到多个具有潜在法医学意义的关键基因；通过对分析结果的比较，探索了SCD 发生发展的生物过程以及法医学诊断相关的潜在特异性生物标志物。本研究共有177 个DEG 在SCD 大鼠心肌中出现差异表达，AGT、C4a、CFD、C6 等基因在非冠状动脉粥样硬化性猝死中发挥关键作用，FOS、CCL2、PI3KR1、CACNA1A、ATF3、NR4A1、TREM2等基因在冠状动脉粥样硬化性猝死中发挥作用，这些基因可作为SCD 法医学诊断的潜在生物标志物。