检测水中重金属镉残留的荧光检测卡 的研制与应用

◎ 孙晶玮，钟松清

（深圳三方圆检测监管服务有限公司，广东 深圳 518000）

水质重金属污染是危害较大的水污染问题之一。镉是一种常见的重金属，有剧毒。人们长期饮用含镉残留的水，会对人体肾脏、肝脏和生殖系统造成不可逆的损伤。目前，检测重金属镉的方法有石墨炉原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法[1-3]等，这些方法具有灵敏度高、应用范围广等优点，但需要昂贵的大型仪器设备、专门的实验室和专业的操作技术人员，不适用于大宗样品的快速筛查。因此，急需建立一种高效、便捷、低成本的重金属镉检测方法，实现水中重金属镉的现场快速筛查。

纳米材料的研究已成为当今国际上的前沿研究课题，荧光微球作为荧光探针标记生物大分子，在分析领域已有重要的应用[4-5]。时间分辨荧光微球是基于镧系元素发光的新型标记材料，其特点是通过延迟读取发射光时间以区分特异性荧光信号和基质背景荧光信号，提高检测灵敏度高[6]。

本研究采用了荧光微球标记抗体，建立重金属镉的新型、快速、实用、灵敏的纳米荧光免疫层析检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铅、汞、镉、铬、铜和铁标准品（1 000 mg·L-1，坛墨质检科技股份有限公司）；镉抗体、镉抗原（纯度95.0%，深圳市三方圆生物科技股份有限公司）；荧光微球，南京微测生物科技有限公司；玻璃纤维垫、硝酸纤维素（NC膜），Millipore公司。

1.2 仪器与设备

划膜仪、数控斩切机，上海金标生物科技有限公司；分析天平，美国Sartorius公司；超纯水系统，美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标记抗体

吸取5 μL荧光微球于2 mL离心管中，加入40 μL 0.05 mol·L-1MES缓 冲 溶 液（pH 4.7），混 匀， 13 500 r·min-1离心20 min，去掉上清，加入40 μL上述缓冲液溶解沉淀，将复溶液转移入另一2 mL离心管中，超声30秒；分别加入4 μL N-羟基琥珀酰亚胺溶液 （10 mg·mL-1）和2 μL碳二亚胺溶液（5 mg·mL-1），室温静置活化反应30 min，13 500 r·min-1离心20 min， 去掉上清，加入40 μL MES缓冲溶液（pH 4.7）溶解沉淀，超声处理1 min，将复溶液转入新的2 mL离心管中；加入适量待标记抗体，避光，室温摇床振荡 1 h；再加入5 μL 10%BSA，封闭1 h，13 500 r·min-1离心15 min，去掉上清，加入50 μL复溶液超声复溶沉淀，4 ℃保存备用。

1.3.2 制备荧光检测卡

检测卡由PVC底板、样品垫、耦联物垫、NC纤维素膜和吸水垫组成。通过实验条件的优化，确定最佳抗原包被量、荧光抗体使用量及羊抗鼠二抗工作浓度。使用滑膜仪将抗原稀释液和羊抗鼠二抗稀释液分别包被在NC膜上，形成检测线T和质控线C，将制备好的NC反应膜置于50 ℃烘箱中干燥1h；将适宜浓度的荧光微球标记的抗体均匀喷涂在耦联物垫上，于室温干燥，备用；裁剪玻璃纤维膜，磷酸缓冲液（1% BSA，0.5%吐温）浸泡30 min，室温干燥，备用；将上述样品垫、耦联物垫、NC反应膜和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，结构如图1所示。

图1 荧光检测卡装置解析示意图

将组装好的检测卡大板切成5 mm宽的检测条，装入检测卡壳中，组装后的检测卡放入带有干燥剂的铝箔袋中，封口，室温保存。

1.3.3 荧光检测卡的判读

本文采用竞争的方法研制检测重金属镉的免疫荧光检测卡。检测样本中的待测目标物在流动过程中先与荧光微球标记的特异性单克隆抗体相结合，再带着标记抗体继续层析，未结合的标记抗体与NC膜检测线（T）上包被抗原结合。如果样本液中含有目标物，检测线（T）显色较浅或不显色，结果为阳性；反之，检测线（T）显色与质控线（C线）相同或略深，结果为阴性；若质控带无显色，表明实验无效。

1.3.4 标准曲线绘制

将1 000 mg·L-1的 镉 标 准 品 溶 液 与1 mol·L-1的EDTA溶液混合，静置反应15 min，用0.01 mol·L-1的PBS缓冲溶液将上述标准品溶液稀释为1 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1和40 μg·L-1的标准品工作溶液。分别取80 μL加至检测卡的样品孔中，室温下反应8～10 min。以T/C比值为纵坐标，标准品浓度的lg值为横坐标，绘制标准曲线图。

1.3.5 荧光检测卡稳定性实验

制备3批荧光检测卡，在室温保存12个月，测试的时间为第7天、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第300天、第330天以及第360天，检测其敏感性变化。

1.3.6 荧光检测卡特异性实验

选取与目标待测物性质相同的同系物进行检测，根据交叉反应，检测所建立的荧光检测卡的特异性。

1.3.7 重金属检测样本处理方法

如果水较混浊需要过滤，则取1 mL待测水样，加入一滴含络合剂的0.02 mol·L-1PBS缓冲液（pH 7.4），混匀，沸水浴5 min，待恢复室温后用一次性滴管取2～3滴（或用移液枪取80 μL）进行检测。

2 结果与分析

2.1 荧光标记抗体量的确定

确定镉抗体与1 mg荧光微球的最佳偶联量，分别检测对应的标准品，用免疫荧光层析检测仪记录检测卡的T/C比值。

如图2所示，随着抗体标记量增加，T/C比值逐渐增大，镉抗体量达到200 μg·mg-1时T/C比值最大，超过该值后，T/C比值逐渐降低，表明抗体加入量不是越多越好，分析可能是由于结合到荧光微球表面的抗体达到饱和，出现了空间位阻，导致标记抗体与抗原结合量降低，从而使检测信号降低。因此确定荧光标记抗体量为200 μg·mg-1。

图2 抗体标记量的确定图

2.2 标准曲线的建立

根据T/C比值与标准品浓度的lg值绘制标准曲线图，如图3所示，线性相关系数R2为0.995，线性范围在1～40 μg·L-1，半抑制率为8.7 μg·L-1，最低检测限为1.5 μg·L-1。

图3 重金属镉的标准曲线图

2.3 检测卡的性能

通过分析比较重金属镉与铬、铅、汞、铜和铁检测结果的显色情况，分析评估镉荧光检测卡的特异性。检测结果如表1所示，重金属镉荧光检测卡与其余金属离子的交叉反应率较低，表明本试剂盒的特异性较好。

表1 重金属镉特异性表

按照1.3.5实验方法，将3批次检测卡在室温下保存，测试的时间为第7天、第15天、第30天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第300天、第330天和第360天，考察其检测敏感性变化。实验结果显示，检测卡在外观、敏感性上无显著差异，说明所制备的检测卡稳定性较好。

按照1.3.7样本处理方法，检测自来水、纯净水、河水等样本，分别添加不同浓度水平的重金属镉离子，每个添加样品测试5次，并计算加标回收率。由表2可知，回收率在85.7%～105.1%，准确度较好；变异系数在5.4%～10.8%，平均变异系数低于15%。

表2 重金属镉的添加回收率表

2.4 与仪器分析法的对比

目前我国检测生活饮用水中重金属的标准为《生活饮用水标准检验方法金属指标》（GB 5750.6—2006）[7]，石墨炉原子吸收光谱法的最低检测限为0.5 μg·L-1。 为对比两种检测方法，选择阴性样品和添加量为20 μg·L-1的阳性样本进行检测，结果如表3所示。

由表3可知，两种方法的检测结果较为一致，表明本荧光检测卡可以用于检测水中镉的快速筛选。

3 结论

本研究在重金属镉单克隆抗体的制备基础上，开发了镉的纳米荧光免疫层析检测卡，经过一系列优化，确定本方法的线性范围为1～40 μg·L-1，灵敏度为 8.7 μg·L-1，最低检测限为1.5 μg·L-1。该方法前处理简单方便，与传统的仪器分析法结果符合性较高，适用于基层现场快速检测。