硝化/脲酶抑制剂对设施菜地土壤菌群和氮素转化影响的研究进展

李鲁震， 赵长盛*， 陈庆锋，2， 刘 婷， 李 磊， 郭贝贝

(1．齐鲁工业大学/山东省科学院 山东省分析测试中心， 山东 济南 250014； 2．山东师范大学 地理与环境学院，山东 济南 250300)

0 引言

我国是蔬菜生产和消费大国，设施蔬菜种植面积约410万hm2，并且设施菜地规模逐年扩大[1]。在我国设施菜地中，为保证设施蔬菜的高产量和满足作物对氮素的大量需求，大量施加氮肥。据统计设施菜地每年施加氮肥高达1 500 kg/hm2，是农田作物的4～6倍[2]，但平均氮肥利用率低于20%[3]。然而，氮肥的科学施用是使农作物增产的前提，科学的氮肥用量约为522 kg/hm2，若氮肥施用过度，易造成土壤硬度增加，降低作物产量，严重降低氮素利用率。氮肥的高施加量和低利用率导致过量氮素在土壤中积累，通过硝态氮淋溶、N2O和NH3的排放等多种途径释放到水体或大气中，会造成严重的环境问题[4-5]。

土壤矿化、硝化和反硝化作用主要是由微生物主导[6]，作用于氮素转化过程，影响氮素在土壤中的迁移与转化，微生物在土壤环境中的作用不言而喻[7]。设施菜地土壤中微生物的结构和丰度根据种植方式、时空变化及氮肥施用量等因素变化。氮肥的高施加量显著降低土壤中菌群的功能多样性，在氮素转化过程中主要受AOA、AOB和nirk反硝化细菌等功能菌群的作用[8]。有机肥的施加为土壤微生物活动提供营养物质，增强其活性，但引进外来微生物和酶类。

由于土壤中微生物的活动、矿化、硝化和反硝化作用，引起了N2O排放及NO3--N淋溶[9]。在农业系统中，氮素以NO3--N形式的损失量高达13 Tg/yr，N2O的释放量约为4.1 Tg/(N·yr)[10-11]，而设施菜地系统中的N2O排放和NO3--N淋溶量通常高于附近或其他大田作物[12-13]。马林等[14]研究表明，设施菜地种植模式下，氮素淋失强度为117.5 kg/(N·hm2)，远高于露天蔬菜、小麦-玉米轮作和春玉米3种种植模式。N2O是重要的温室气体，NH3虽不是温室气体，但促进N2O产生[15]。在整个农业生态系统中，设施菜地系统与其他系统相比，由于环境封闭、施肥量大、灌溉频繁且相对较高的土壤温度和含水率等特点，氮素淋溶的风险性最高[16-17]。

虽然研究者已进行一些实地研究，量化设施菜地的N2O排放或NO3--N淋失[18]，但由于氮素淋溶存在较大的时空变化，具有局限性，仍缺乏最佳的氮肥管理措施[19-20]。与其他农业模式相比，对设施菜地系统氮素淋溶机制的研究较少，开展氮肥、硝化抑制剂和脲酶抑制剂对不同种植年限设施菜地系统中菌群和氮素淋溶影响的研究，对氮肥资源化利用、减少环境污染、促进农业可持续发展具有重要价值，并为土壤菌群的作用机制等方面奠定基础。

1 设施菜地土壤氮素转化途径

在设施菜地土壤中，植物吸收土壤中的部分氮素以满足生长需要，为保持土壤环境系统内的氮素平衡，需要对这部分土壤施加氮肥或有机肥。土壤是一个动态生态系统，涵盖生物、有机物、无机物、水和空气。土壤中存在的氮素种类不同，不同形态氮素之间的转化过程可表征土壤的供应能力[21]。

1.1 土壤有机氮矿化

土壤中氮素主要以有机氮形式出现，而植物吸收利用的是无机氮，需要经矿化过程使有机氮转变为无机氮，被作物直接吸入体内参与物质循环[22-23]。在氮素矿化时，无机氮发生积累和淋溶，造成农业非点源污染。在氮矿化方面，国内外学者对不同类型的土壤进行长期研究表明，产生的大量N2O使研究区域气温上升，土壤中无机氮含量和氮素利用效率与氮素矿化速率呈正相关[24]。过燕琴等[23]研究发现，在氮素矿化量和矿化速率方面，设施菜地明显高于露天菜地。MINGZHU等[25]研究认为，尿素的添加未改变土壤总氮矿化速率，但可促进活性有机氮的矿化。

土壤氮素矿化过程受到土壤含水量、土壤温度和微生物等影响[22]。在含水量低的情况下显著影响土壤中微生物生长，使矿化作用受到阻碍，降低矿化速率。土壤温度对微生物活性的影响较大，在低温环境中阻碍硝化细菌的硝化功能；相反，在高温环境中，微生物的反硝化作用会加强，生成N2O和N2，但降低氮素利用率。STANFORD等[26]研究发现在-4～40℃，土壤氮矿化量与温度呈正相关。周才平等[27]对不同含水量的2种森林土壤进行研究表明，当温度在5～35℃，矿化速率随温度的上升而增加。

1.2 土壤氮素硝化及反硝化作用

硝化过程可谓是全球氮循环、植物营养和环境治理过程的重要一步。硝化速率越高，作物氮素利用效率可能越低，硝化作用的第一步和限速过程是由微生物AOA或AOB进行[28]。在氮素转化的过程中，硝化作用和反硝化作用主要影响因子有温度、含水率、pH、有机质含量等[29-30]，因此，可以确定不同种类土壤的硝化和反硝化活性之间存在差异。

大气中90%的N2O来源于土壤硝化和反硝化作用，土壤硝化过程是土壤氮素转化的关键过程，也是导致干旱土壤中N2O排放的重要途径之一[31]。氨氧化微生物主导的氨氧化过程限制硝化过程，有副产物N2O产生，氨氧化微生物对N2O的排放有关键作用[32-33]。针对NO3--N淋溶问题，崔敏等[34]研究发现，北方大部分蔬菜种植区域的土壤和地下水中NO3--N含量严重超标。巨晓棠等[35]针对北京地区的设施菜地土壤研究显示，深度为4 m的土壤中NO3--N的累积量高达1 230 kg/hm2，深度为2～4 m的土壤中434 kg/hm2的NO3--N不能被作物吸收，氮素损失量是粮食作物系统的3.5倍。

BURTON等[36]将原生林和种植园林土壤作对比发现，在形成对比的原生林生态系统中，硝化作用占有优势。ALLEN等[37]在深入探讨河口和树林土壤产生N2O时空变异时认为，由于氧化还原电位的影响，使得硝化作用占主导地位。HUYGENS等[38]通过15N同位素示踪法研究首次发现将近99%的异化硝态氮还原成铵态氮，并认为在南方森林土壤中主要是反硝化过程。其不仅确保土壤中氮素的积累，还对维持土壤养分具有一定价值。苏静等[39]研究表明，pH主要通过影响NH3含量的变化和土壤的硝化速率，导致其对土壤硝化作用和微生物具有显著影响。若研究对象是热带区域酸性土壤，氨肥的施加可能影响其酸碱度，使其上升，但不会直接对土壤发生硝化反应产生任何影响[40]。不同年限和不同季节的NO3--N淋失量差异显著，若在我国华北地区的设施菜地，夏季的NO3--N淋失量最大。

2 氮肥和抑制剂对氮素转化和酶活性的影响

2.1 设施菜地氮素转化

2.1.1 过量施肥 农民为保持和增加作物产量，大量施用氮肥。然而，有研究表明，过量施肥可能重新塑造设施菜地系统中的菌群，增加N2O的排放和NO3--N的淋溶量[21]。滴灌施肥已被证实是一种通过直接将水和养分输送到作物根部以提高作物产量、节省氮投入和减少水分利用的先进技术[41]。有研究认为，地表滴灌施肥联合硝化抑制剂是解决该地区氮肥施用过多、地下水抽采过多问题的较好选择[42]。ZHANG等[43]利用DNDC模型对温室蔬菜的评估显示，有机肥或合成氮肥的施用量增加明显增加N2O的排放和NO3--N的淋溶，但不会使蔬菜产量持续增加，总体上有机肥优于尿素的施加效果。

2.1.2 硝化抑制剂 硝化抑制剂对土壤环境有显著影响，通过调控土壤中酶的活性，减少氮素的损失[44]。2-氯-6(三氯甲基)-吡啶(CP)是常用于农业土壤中的硝化抑制剂，硝化抑制剂的核心机制是通过铜螯合使氨单加氧酶失活，从而阻碍氨氧化剂的增加[45]。研究发现，生物有机肥的使用提高土壤氮素含量，而硝化抑制物质的施加能够在一定程度上控制土壤中氮素转化从而明显提高氮素转化效率[25]。硝化抑制剂有效抑制硝化过程的同时，也成为农业土壤中最普遍应用的肥料添加剂之一[28]。然而，硝化抑制剂与脲酶抑制剂的联合使用可以更有效控制N2O的形成以及对氨氧化微生物的反应机理值得进一步深入研究[46]。此外，CP与有机肥结合对设施菜地土壤NH3的释放机制仍不明确。

许纪元等[47]在研究CP对设施番茄氮素迁移的影响时发现，当施氮量为300 kg/hm2时，施加CP可使番茄增产31.4%，氮肥回收率提高9.2%，但氨排放增加3.65 kg/hm2。研究表明，CP对于减少氮素损失有促进作用，可减少农田土壤的N2O排放，但施加CP存在NH3释放增加的风险[48-49]。探讨CP在不同土壤环境下对氨氧化微生物的影响时发现，CP对AOA和AOB等菌群的抑制作用对于不同的土壤类型效果存有差异[50]。

2.1.3 脲酶抑制剂 脲酶作用于土壤中的尿素，而脲酶抑制剂则能抑制尿素在土壤中的水解速率。比较多种脲酶抑制剂，正丁基硫代磷酸酰三胺(NBPT)是最有效的脲酶抑制剂之一。NBPT在土壤中转化为类似物N-(正丁基)三酰胺磷酸(NBPTO)，最终使脲酶失活，减缓尿素水解[51-52]。NBPT的特点是迅速出现效果且持续周期较长，适用于多种土壤类型。然而，除减少底物供应外，NBPT对硝化过程的影响机制仍不清楚[53]。

脲酶抑制剂可以延长氨态氮在土壤中的滞留时间，从而提高肥料的肥效，减少氮肥施用对气候和环境的影响[54]，并且抑制AOB、AOA及相关酶的活性，有效的延缓NH4+氧化成NO3-，减慢了NO3-积累，使土壤具有较高的NH4+含量[55]。万年鑫等[56]通过综合多因素的研究发现，NBPT能明显减少尿素的损失，增加秋马铃薯产量，且其效果优于CP处理。赖睿特等[57]研究发现，硝化抑制剂、脲酶抑制剂以及生物质炭的使用，均可能抑制养殖肥液灌溉之后N2O排放，不利于硝化过程的进行，而且2种抑制剂的组合效果明显优于单一抑制剂。在实验室和田间试验中，NBPT的效果最好，可以将尿素肥料中的氨排放量减少30%～70%，将NBPT添加到尿素和硝酸铵溶液肥料中可以减少50%的氨排放[58]。综上所述，以设施菜地为研究对象，NBPT抑制N2O和NH3的产生，减缓氮素淋溶速率。

2.2 氮肥配施抑制剂影响酶活性

设施菜地土壤中生物的分泌物及其肢体残留物和细菌等可产生的酶类在进行全系统的物质循环和能量转换等各方面发挥不可或缺的功能[56]。根据土壤酶活性可推断微生物的活性，目前如何利用这种土壤酶活性表征大气中的污染物对于土壤各方面的影响逐渐成为热点话题。土壤氮素转化主要依靠相关微生物和各种酶完成，土壤中存在各种转化酶、脲酶、氧化还原酶等，各自在各领域发挥着不同的酶促作用。土壤酶主要以吸附态的方式存活，与其他腐殖质相互联系并共存，提升土壤酶活性有助于增加土壤肥力。

与土壤氮素转化密切相关的3种酶为土壤脲酶、硝酸还原酶和亚硝酸还原酶[46]。由于设施菜地系统属于密封性强、高温高湿的环境，明显提高土壤酶活性和酶对底物的结合能力[59]。

在其作用机制方面，具有抑制脲酶活性功能的脲酶抑制剂在一定程度上能够抑制氮肥的吸收和水解，而硝化抑制剂对于土壤氮素转化过程中酶活性的影响不同。李君[44]研究表明，在小麦抽穗与灌浆期间，单施尿素处理的脲酶活性与对照处理相比无显著差异，而尿素配施2种抑制剂的处理显著优于其他处理。从结果分析，土壤中亚硝酸还原酶和硝酸还原酶活性在施肥条件下会发生变化，抑制剂的使用对两者有不同的影响，使得亚硝酸还原酶活性有所降低，硝酸还原酶活性得以改善。总之，关于设施菜地土壤酶活性的研究较少，但在整个农业土壤氮素循环体系中，设施大棚内土壤矿化过程越剧烈，土壤酶活性越高。

3 土壤菌群

李君[44]通过末端限制性片段多态性分析(T-RFLP)研究设施菜地在不同栽培年限下土壤中微生物种群结构的改变情况并结合实时荧光定量PCR方法定量分析AOA、AOB和nirK型反硝化细菌群落丰度的变化情况。在菌群分析中光循环仪480II系统中，通过定量实时聚合酶链反应研究硝化和反硝化过程中微生物功能标记基因的丰度[60]。

研究表明，过量施肥对设施菜地土壤微生物的结构有显著影响，使微生物的种类明显减少，与减肥作对比发现，Rhodanobacter属的菌群被过量富集[21]。除此外，添加生物质、硝化抑制剂、脲酶抑制剂或新兴有机污染物DEHP等对菜田中的细菌、反硝化细菌等微生物群落结构及丰度等方面产生一定的影响。CHEN等[61]在研究生物炭和硝化抑制剂对N2O排放与氨氧化微生物影响时发现，生物炭对AOA和AOB的生长均有促进作用，而DMPP单独抑制了AOB的活性和生长。TAO等[62]研究表明，硝基吡啶(NP)的添加显著减少石灰性土壤中AOB的丰度，抑制红壤中AOA的生长，且线性回归分析表明，红壤PNR与AOB和AOA丰度呈正相关，而钙质土壤仅与AOB呈正相关。MENG等[53]研究发现，硝化抑制剂DCD(双氰胺)使得AOB停滞生长，并抑制AOB在硝化反应过程中的作用，NP和NBPT阻碍AOA的生长。微生物在设施菜地作物生长和氮素循环方面存在显著差异，如何提高氮素利用率和作物质量、氮肥配施2种抑制剂在设施栽培条件下对AOA、AOB和其他土壤微生物菌群的影响机制成为关键问题。

4 展望

研究氮肥配施抑制剂对设施菜地土壤菌群及氮素淋溶的响应机制，是为了调控土壤氮素转化过程，提高氮素利用率，减少氮素淋溶，增强土壤肥力。结合设施农业发展、氮肥利用与环境保护三条主线，可开展以下几方面研究工作：研究氮肥、CP和NBPT三者联用对土壤氮素转化的影响，以矿化速率和硝化速率表征；不同处理对N2O和NH3排放的影响；不同处理对土壤微生物量碳、微生物量氮和土壤酶活性的影响；利用16S rRNA分析氨氧化微生物和nirk反硝化细菌等土壤菌群的丰度变化，并探讨菌群丰度与土壤潜在硝化势(PNR)和N2O排放量的关系。