肿瘤微环境中外泌体对肿瘤干细胞作用的研究进展

时秀茹，王文锐，杨清玲，陈昌杰

(蚌埠医学院 1.癌症转化医学安徽省重点实验室；2.生物技术教研室；3.生物化学与分子生物学教研室，安徽 蚌埠 233000)

肿瘤已成为危害人类生命健康的重要因素，肿瘤的耐药、化疗抵抗和治疗后复发已成为攻克肿瘤的重要阻碍。而肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)被认为是这一难题产生的重要原因。CSCs是一群所占比例很小、具有高度自我更新能力的异质性细胞群。CSCs的存在及其干性维持离不开肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)。其中在TME中发挥信息交流功能的外泌体对CSCs表型的产生、干性维持，化疗耐药等方面具有重要作用。外泌体是一种可由多种细胞分泌的细胞外囊泡，其大小在30～100 nm之间，内容物为多种非编码RNA，蛋白和核酸等，通过与受体细胞结合释放内容物完成细胞间信息交流。探讨外泌体对CSCs的作用有利于更充分的认识肿瘤发生的分子机制，为肿瘤治疗提供新方向。

1 CSCs与TME

TME包括肿瘤细胞、CSCs和肿瘤基质细胞等多种成分。相关研究表明，TME中的多种细胞成分对CSCs相关特性的维持发挥重要作用。一方面，肿瘤基质细胞与肿瘤细胞相互作用改变肿瘤表型，构建适宜肿瘤生长的微环境。例如，肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)通过增强胰腺癌干细胞的分泌磷蛋白1基因的表达[1]，进一步增强胰腺癌干细胞的干性，具体表现为CD44、ALDH阳性细胞群表达增加，肿瘤球比例上升。此外，TME中的细胞因子也促进CSCs的干性、耐药性等。肌成纤维细胞释放的细胞因子IL-6/IL-8可增加结直肠癌干细胞的数量[2]；癌相关的间充质干细胞通过细胞因子的相互作用促进卵巢癌干细胞的化学耐药性[3]；肿瘤相关巨噬细胞通过配体结合影响头颈部鳞状细胞癌干细胞重要表面分子标志物CD44的动能[4]，进一步影响干性。此外，相关报道表明缺氧环境也会影响干细胞表型及存活。可见，TME各细胞组分以及环境条件影响着CSCs的干性。另一方面，CSCs分泌产生的相关细胞因子也同步影响着TME中成员细胞的表型和特定属性。肺癌干细胞中，干性基因OCT-4的表达可增加巨噬细胞集落刺激因子的含量以促进TME中单核细胞极化成为M2型巨噬细胞[5]，发挥促肿瘤作用；肿瘤干样细胞来源的外泌体RNA引发嗜中性粒细胞[6]，以促进结肠癌的肿瘤发生。TME是肿瘤赖以生存的基地，为CSCs表型形成、干性和耐药性增强提供支持。二者的相互作用对维持CSCs动态平衡以及形成肿瘤转移前壁龛具有重要作用。

2 外泌体与肿瘤

越来越多研究表明，外泌体在肿瘤发生发展中发挥重要作用。外泌体参与细胞抗凋亡通路、激活细胞增殖通路以促进肿瘤的恶性进展。首先，外泌体增加肿瘤耐药性，促进耐药表型的获得。研究指出利用耐药细胞的外泌体处理敏感细胞会增加细胞的化学抗性，诱导细胞凋亡。CAFs通过将外泌体直接转移到结直肠癌细胞中发挥作用[7]，促进结直肠癌细胞中miR-92a-3p水平显著升高，激活Wnt/β-catenin通路并通过直接抑制FBXW7进而抑制线粒体凋亡，促进结直肠癌细胞的干性、上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)和转移。其次，外泌体可通过调节细胞外基质和EMT进程促进侵袭、迁移。其中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)促进血管细胞的增殖、发芽和血管形成从而促进肿瘤生长、侵袭。外泌体中相关成分通过靶向VEGF通路促进体外小鼠模型肿瘤的生长速度[8]。研究还表明，经历EMT的乳腺癌细胞分泌的VEGF-C通过非典型激活GLI信号传导促进旁分泌介导的上皮乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的增加[9]。最后，外泌体参与肿瘤免疫。一方面，外泌体参与抗肿瘤免疫，即可呈递抗原激活T细胞、NK细胞或巨噬细胞。如，肿瘤外泌体中干扰素调节因子1可诱导增加CD4+CD8+T细胞在肿瘤中的浸润[10]，启动抗肿瘤免疫。另一方面，外泌体还发挥促肿瘤免疫的作用，即肿瘤细胞来源的外泌体可以抑制免疫细胞活化并调节其功能。例如，来自胰腺导管腺癌小鼠的唾液外泌体调节NK细胞的表型和抗肿瘤细胞毒性[11]，导致NK细胞的肿瘤杀伤能力降低。可见，外泌体参与肿瘤发展始末，调节肿瘤生长微环境。

3 外泌体对CSCs的作用

3.1 外泌体参与并维持CSCs干性外泌体属于细胞外囊泡，由细胞调控其释放及摄取以完成细胞生物功能的发挥。CSCs所分泌的外泌体被受体细胞摄取参与肿瘤干性相关通路，进一步增强CSCs的干性，形成正向促进作用维持肿瘤异质性。研究表明，Wnt、Notch信号通路参与肿瘤干性调控，外泌体包含的非编码RNA可参与Wnt信号通路，调节CSCs的成球能力及肿瘤细胞的成瘤大小。不仅如此，外泌体可携带干性相关因子如OCT-4、SOX-2、NANOG或者通过LncRNA/microRNA介导干性相关因子表达增强以维持干性状态和自我更新能力。研究指出有些CSCs标志物也影响着肿瘤细胞的外泌体释放和迁移侵袭能力。双皮质素样激酶1被认为是癌症干细胞标记物[12]，研究已表明其以激酶依赖性方式影响外泌体的生物发生，通过诱导外泌体释放增加及内容物的重编程以促进迁移表型的获得。TME中，CAFs来源的外泌体也参与干性维持，缺氧条件下，CAFs外泌体将circHIF1A转移到乳腺癌细胞中[13]，其通过调节乳腺癌干细胞表面标志分子CD44的表达来吸收miR-580-5p，从而在癌症干细胞特性中发挥重要作用。总之，TME中各组分分泌的外泌体促进CSCs维持干性和致瘤性。

3.2 外泌体促进非CSC向CSC转化CSCs并非是处于干性状态而一成不变的，CSC与非CSC处于一种动态平衡的状态。外泌体参与该动态平衡的维持。Li等表明外泌体FMR1-AS1可激活TLR7-NFκB信号，增加食管鳞状细胞癌细胞中c-Myc的表达水平以维持食管鳞状细胞癌干细胞的动态互变状态[14]。首先，CSCs的自我更新能力可以保持CSCs处于一定数目。其次，肿瘤细胞可去分化、获得干性而转化为CSCs，维持CSCs数目稳定。肿瘤细胞在其微环境的影响下向未成熟状态逆分化代表了EMT和获得干性特征的第一步[15]。外泌体作为TME的重要组分，其包含的大量活性物质通过复杂的信号网络介导这一转化过程。EMT促使肿瘤细胞失去极性，获得具有更高侵袭能力的间质表型。同时，EMT还可促进上皮非CSCs转化为能够产生肿瘤细胞并促进肿瘤细胞扩散的间充质CSCs[16]，这其中细胞发生的转录和蛋白质组学十分复杂。研究表明，这一过程可由CSCs外泌体介导。而在CSCs中去除前列腺素E2后分泌的外泌体可导致CSCs失去CSCs标志物[17]、间充质标志物、整合素和药物外排转运蛋白等，这就解释了外泌体促进CSCs转化的分子机制。相应的，CSCs也会失去干细胞表型转化为非CSCs细胞以维持肿瘤细胞中CSCs的动态平衡。

3.3 外泌体促进CSCs表型形成CSCs存在多种假说，有假说称，CSCs起源于TME中的正常干细胞，在致瘤微环境中逐步获得CSCs表型，而来自肿瘤细胞的外泌体启动或促使这一过程。用外泌体处理的干细胞获得了CSCs的特征，即悬浮培养中出现表达干性标记的球体和Balb/c裸鼠的高致瘤性。更确切的说，外泌体携带的多种蛋白、非编码RNA等物质促使CSCs表型的获得，如多能转录因子NANOG、OCT-4和Wnt族蛋白，它们可以促进细胞自我更新、受体细胞的干性和细胞可塑性的改变。研究表明，肿瘤衍生的细胞外泌体可以通过转移它们所包含的肿瘤特异性分子EZH2和GLI1来维持神经母细胞瘤中CSCs的未分化表型并调节周围细胞向CSCs转化。在其他致癌物作用下，正常细胞所分泌的外泌体也会促进CSCs样表型的获得。例如，砷转化的前列腺上皮细胞可通过外泌体信号传导将正常干细胞募集、形成CSCs样表型[18]。由此可见，CSCs样表型可在不同致癌环境下和肿瘤微环境下由外泌体介导所获得。

3.4 外泌体促进CSCs化疗耐药CSCs现已被认为是肿瘤化疗和耐药的主要原因。现有研究已提出多种CSCs耐药的机制，如通过ABC转运蛋白的药物外流、DNA损伤反应的过度激活、细胞凋亡逃避、生存通路激活、细胞周期促进和/或细胞代谢改变等。CSCs产生耐药与多种固有因素[19]：EMT、信号通路等相关。TME的作用是CSCs获得耐药性的另一重要因素：缺氧以及酸度增加(糖酵解所致)的微环境下通常存在更多的CSCs并且往往具有更强的异质性和干性。而外泌体通过参与药物外排、EMT、干性特征来介导耐药性。研究表明，耐药细胞中的化学抗性物质通过释放外泌体中miRNA等内容物转移到药物敏感性细胞中。在CSCs中[20]，耐药细胞株中的CSCs释放的外泌体可转移、增强非耐药细胞CSCs的耐药性。在肿瘤基质细胞中，来自成纤维细胞的外泌体可诱导结直肠肿瘤细胞去分化转变成具有干性表型和功能的CSCs[21]，由此增强了结直肠癌细胞的化疗抗性。化疗会促使肿瘤细胞分泌含有与耐药相关miRNA的外泌体，这些外泌体通过作用于干性通路，导致CSCs干性和耐药性增加。目前，获得性化疗耐药机制对于CSCs化疗耐药的机制研究具有重要意义。

3.5 外泌体促进CSCs在微环境中的信息交流外泌体作为细胞外囊泡，其最主要、最基本的作用是完成细胞间、细胞和微环境间的信息交流[22]。外泌体包含的大量的DNA、microRNA、LncRNA、脂类、蛋白质等物质随血流或者以旁分泌的形式到达受体细胞，实现长距离或者相邻细胞间的通讯交流，以完成肿瘤生长、转移、耐药。研究指出[23]，化学敏感性非干细胞(non-stem cancer cells,NSCCs)被认为是TME中CSCs生态位的一部分。NSCCs衍生的外泌体含有富含蛋白质稳态相关功能的货物蛋白，并显著改变CSCs的发育，使其具有更强的内在化学抗性、侵袭性和更好的自我更新能力。由此确定了一种新的交流机制：NSCCs的外泌体可以通过这种机制改变CSCs的相对适应性以促进疾病进展和获得化学抗性。外泌体参与CSCs和基质细胞之间的通信循环，从而参与CSCs自我调节和生存微环境的调节。上述外泌体对CSCs的作用均有赖于外泌体实质上是信息交流的载体。

4 前景与展望

CSCs作为肿瘤中极为复杂的成分，其表型形成及功能属性有赖于TME的存在。而CSCs通过分泌外泌体和细胞因子构成通讯网络完成表型的获得和功能的增强。由于外泌体对肿瘤发展和CSCs的强大影响[24]，新的抗肿瘤疗法侧重于靶向外泌体通信网络以根除肿瘤并防止肿瘤转移、复发和耐药。而且外泌体有望在液体活检[25]、免疫治疗和抗肿瘤药物递送等方面发挥特异作用。总之，外泌体在靶向CSCs治疗中具有很大的应用潜能，随着对外泌体成分的不断深入研究，相信外泌体将会在更多领域及临床得到应用。