一株椰毒假单胞菌酵米面亚种在培养基中的生长规律和产毒研究

严琼英，李乐诗，孙钰涵，林泽宇，罗尔伦，陈 晶

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳 518131）

椰毒假单胞菌酵米面亚种（Pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans）是 1977年 中国学者在东北酵米面中毒事件中发现的食物中毒菌[1]，可产生毒黄素（Toxoflavin，TF）和米酵菌酸（Bongkrekic Acid，BA），能引起高致死性的食物中毒。据文献[2]报道，发病率可高达96%，病死率高，是迄今为止我国发现的发病率和死亡率极高的食源性致病菌。该菌具有与其他细菌不同的产毒特点，可产生外毒素米酵菌酸，在相同条件下，米酵菌酸产量比毒黄素大，毒性比毒黄素强[3]。

研究发现米酵菌酸是一种具有较强生物活性的毒素，随污染的食物进入人体后可引起恶心、呕吐、腹胀、腹痛等，严重者出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、血尿、血便等肝脑肾实质性器官损害症状[4-6]。近几年，我国发生过多起食用含有米酵菌酸的食品导致中毒死亡的事件。例如，2012年山东省临沂市，2014年云南省文山州，2018年广东省东莞市，2020年黑龙江省均发生过食用被米酵菌酸污染的食品导致的中毒死亡事件[7-9]。

椰毒假单胞菌酵米面亚种适宜生长温度为26～37 ℃[10]，且该菌代谢多样性丰富，对碳源要求不高，在有任一可利用的有机化合物存在下即可生长繁殖，在适宜的温度和湿度条件下，短时间内可产生大量毒素[11]。孟昭赫等[12]采用正交设计法研究了实验条件下影响椰毒假单胞菌酵米面亚种的产毒能力情况，发现对产毒能力的影响程度大小依次为菌株、培养基、温度、pH值、培养时间，且最适产毒温度为26～28 ℃。黄伟峰等[13]研究椰毒假单胞菌酵米面亚种的选择性培养基时涂布接种血琼脂平板作为对照培养基进行生长率试验。汪廷彩等[14]文献报告该菌在生长过程可形成生物膜，定植于基质表面。此特性可能是GB 4789.29—2020中采用PDA半固体表面接种培养法获得菌株的代谢产物米酵菌酸的原因之一。国标中的产毒培养需要至少6 d，且培养物需冰冻过夜和过滤才得到毒素粗提液，操作复杂，耗时长。

目前针对椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株在培养基中的生长规律和产毒情况研究较少，项目组将实验室分离到的椰毒假单胞菌酵米面亚种菌株接种到PD水培养基中，通过考察不同初始染菌量、不同温度（4 ℃、26 ℃、36 ℃）培养下的测定菌液浓度和米酵菌酸浓度，以及考察静置和振荡不同培养方式下测定培养物中米酵菌酸浓度的方法，研究椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长规律与产毒情况。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

椰毒假单胞菌酵米面亚种（本实验室编号为83756），为实验室按GB 4789.29—2020方法分离，VITEK 2 Compact全自动生化鉴定系统生化鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌，经GB 4789.29—2020方法产毒培养后采用《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》（GB 5009.189—2016）方法检出米酵菌酸。

1.1.2 主要试剂

血琼脂平板（郑州安图生物工程有限公司）；马铃薯葡萄糖水（PD水）（青岛海博）；米酵菌酸标准品（纯度96.9%，浓度1 mg·mL-1，安谱）；甲醇和乙腈（HPLC 级，德国 Merck 公司）；甲酸（HPLC 级，德国CNW 公司）；氨水（分析纯，广州化学试剂厂）；色谱柱（Agilent TC C18250 mm×4.6 mm，Agilent 公司）；超纯水（18.2 MΩ·cm，实验室Milli-Q 自制）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Ultimate 3000型，德国赛默飞世尔）；生化培养箱（SHP-250型，上海精宏）；冷藏箱（HYC-390型，海尔）；电热恒温培养箱（INE600型，德国 Memmert）；比浊仪（Densimat型，法国生物梅里埃）；恒温培养振荡器（HZP-250，上海精宏）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验用菌株培养物制备

将椰毒假单胞菌酵米面亚种83756株接种于血平板 37 ℃ 培养 24 h。

1.3.2 PD水静置培养菌株生长规律和产毒变化实验

挑取1.1.2血平板培养物制备0.5麦氏浊度的菌悬液，经10倍系列稀释获得102、104、106CFU·mL-1数量级菌液作为初始污染菌液量，并将10-5和10-6稀释度菌液涂布血琼脂平板进行计数，确定接种量，以下用低、中、高浓度菌液分别代表3个数量级的菌液。同时各取1 mL菌液接种于100 mL PD水中，分为3组，分别放置于不同温度（4 ℃、26 ℃、36 ℃）下静置培养。

每 12 h （培养 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）取出不同培养温度的3组培养物，取1 mL加入9 mL生理盐水稀释液中进行10倍系列稀释，选合适的2个连续梯度取0.1 mL涂布血琼脂平板，36 ℃培养48 h并计数，同时取10 g培养物按GB 5009.189—2016进行BA浓度检测。

1.3.3 PD水静置、振荡培养产毒变化实验

将约108CFU·mL-1浓度菌液作为初始污染菌液量分别取1 mL加到PD水中，分两组，一组放置于36 ℃静置培养，另一组放置于36 ℃摇床150 r·min-1振荡培养，于24 h、48 h、72 h 3个时间点取出，取10 g培养物按GB 5009.189—2016测定其米酵菌酸浓度。

2 结果与分析

2.1 PD水静置培养菌株生长规律及产毒变化

2.1.1 4 ℃培养菌株的生长规律及产毒变化

低、中、高3个初始浓度的菌液在4 ℃下培养72 h内，各时间点PD水均呈澄清状态；对培养物进行菌落计数，如表1所示，菌液浓度在72 h内均在相应初始菌液的同一数量级，表明该菌在4 ℃基本停滞生长。低、中、高浓度初始菌液的PD水培养72 h，其培养液中未检出米酵菌酸，检出限为 5 μg·kg-1。

表1 4 ℃培养液中米酵菌酸浓度和菌液浓度变化

2.1.2 26 ℃培养菌株的生长规律及产毒变化

如图1所示，低、中两个初始浓度菌液的培养液在26 ℃下培养，菌株在培养的第24 h开始菌液浓度有明显增长，在72 h的培养过程中菌落数可达到108CFU·mL-1；但整个培养过程中未检测到米酵菌酸。在高浓度初始菌液的PD水中，菌落浓度值在107～108CFU·mL-1，可检测到少量的米酵菌酸，浓度范围为 5.48 ～ 6.72 μg·kg-1。

2.1.3 36 ℃培养菌株的生长规律及产毒变化

如图2所示，低、中、高3个初始浓度菌液在36 ℃下培养72 h内，菌株83756均生长迅速，每个浓度的初始菌液在培养24 h后都能产生米酵菌酸。低浓度初始菌液的PD水中培养至72 h的过程中，米酵菌酸的浓度较低，为5.04～7.23 μg·kg-1；中、高浓度初始菌液的PD水在培养过程中，在60 h后，米酵菌酸增长了40多倍，为242 ～ 354 μg·kg-1。

2.2 不同培养方式产毒变化情况

表2的实验数据显示，36 ℃培养72 h内，菌株在PD水中静置培养，培养液中米酵菌酸的浓度最高才达到149.8 μg·kg-1。当改变为振荡培养方式时，菌株产生的米酵菌酸迅速增多，24 h、48 h、72 h这3个时间段米酵菌酸数值均为静置培养时的20多倍，说明用液体培养基培养时，振荡培养方式更有利于椰毒假单胞菌酵米面亚种产生米酵菌酸，且产毒量比静置培养高出20倍以上。

表2 菌株在不同培养方式下产毒能力比较

3 结论与讨论

本次生长规律实验中，培养温度对菌株83756的生长影响显著。4 ℃培养72 h，3个初始浓度的菌液基本处于生长停滞的状态，而在26 ℃、36 ℃培养72 h，PD水中菌株快速生长，说明了该菌在4 ℃条件下不生长繁殖，但也没有出现明显的凋亡现象，且最佳培养温度为26～36 ℃。

本次产毒规律实验中，培养温度、初始菌液量、培养方式（是否振荡）可影响菌株83756的产毒能力，主要体现在以下3方面。①培养温度。4 ℃条件下，不论初始菌液浓度高低，均不利于菌株产毒。随着温度的升高和初始菌液浓度的增加，菌株83756的产毒能力逐渐增强。静置培养过程中，36 ℃培养至72 h，3个初始菌液浓度培养物产生的米酵菌酸浓度均比4 ℃、26 ℃的高，表明这株菌的最适产毒温度为36 ℃，菌株对产毒条件的影响较大。②初始菌液量。36 ℃静置培养过程中，低、中、高浓度初始菌液培养物在60 h时浓度均达到108CFU·mL-1，但低浓度初始菌液培养物产生的米酵菌酸浓度却比中、高浓度下产生的低了40多倍。说明在72 h内，低浓度初始菌液在PD水静置培养中产毒能力较低，初始菌液浓度越高，产毒能力越强。③培养方式。该菌株在PD水中36 ℃采用振荡培养方式培养产生的米酵菌酸迅速增多，比静置培养高出20多倍。项目组分析，椰毒假单胞菌酵米面亚种产毒过程对氧气的依赖性较强，静置培养至48 h后，PD水中的氧气消耗快速，氧气通过空气扩散补给速度较慢，产毒能力受限。采用振荡培养方式，可以有效增大氧气供给方式，使产毒菌株产毒能力明显增大。

本实验研究中，PD水液体培养基振荡培养法比静置法更有利于椰毒假单胞菌酵米面亚种产生米酵菌酸，相比国家标准GB 4789.29—2020的产毒培养，前者操作简单，更容易获得毒液提取液进行米酵菌酸测定，为未来进一步优化现有国标产毒培养方法提供了方向。