单细胞测序在肿瘤药物开发中的应用

袁鎏柳，秦成姣，边静，夏元铮

（ 中国药科大学中药学院，江苏 南京 210009）

0 引言

肿瘤是人类面临的一大健康威胁[1]，肿瘤组织中的细胞类型多种多样，单个细胞同样具有不同特性。以往科研人员从大量细胞中获取DNA样本进行测序，测序结果仅能展现细胞群体表征。由于细胞间异质性的存在，相同表型的细胞遗传信息可能存在显著差异，很多低丰度的信息在整体表征中会被丢失。2009年汤富酬教授在国际上率先发展了单细胞功能基因组学研究体系，这一技术弥补了传统高通量测序的局限性，开启了单细胞转录组测序时代[2]。2011年单细胞测序技术被Nature Methods评为年度最值得关注和期待的技术之一，此后越来越多地被应用于科学研究领域[3]。2018年三篇Science[4-6]以精确的方式跟踪并描绘了组织以至整个机体从单细胞发育而来的完整历程，成为年度最重要科学进展，位居十大科学突破榜首。目前已有多种处理单细胞测序的流程，比如STRT-Seq[7]，sci-RNA-seq[9]，Drop-seq[10]，MARSseq[11]，SAMRT-seq2[12]，Fluidigm C1[13]，WaferGen ICELL8[14]，10xGenomics[15]等。这些技术的快速发展使我们能够快速获取大量肿瘤相关生理病理信息。鉴于单细胞测序的最新进展，它在人类疾病中的应用可能有助于更好的理解病理过程[16]。我们假设，单细胞测序可以通过在单细胞水平上观测基因表达，以此提供一种强大的个性化医疗手段，这不仅加深了我们对疾病发展机制的了解，而且可以鉴定出特异性变化通路或潜在靶标，使通过目前可用的单克隆抗体或小分子靶向抑制剂治疗成为可能[17]。为此，我们总结了目前单细胞测序技术在分析肿瘤异质性、肿瘤药物研发、药物筛选等方面的研究进展。

1 单细胞测序在分析肿瘤异质性中的应用

肿瘤异质性描述了同一类型肿瘤在不同患者之间的差异，以及肿瘤内部不同细胞之间的差异，两者都会导致对治疗的不同反应。肿瘤细胞之间的遗传和表观遗传差异可能解释了为什么在癌症治疗结束后，一些肿瘤细胞仍然存在于患者体内。近年来，在研究肿瘤异质性和动态可塑性方面取得了重大进展，了解不同肿瘤异质性对于基础研究，以及将基础研究成果应用到临床治疗方案设计中具有重要意义[18]。G. Gambardella等[19]对32个乳腺癌细胞系中35276个单个细胞进行转录组数据分析并生成单细胞图谱，通过在图谱上训练迭代反褶积算法，根据肿瘤活检中大量基因表达谱确定细胞谱系组成，实现了基于细胞谱系的患者分型。

为了在单细胞水平上预测药物反应，这项研究开发了一种生物信息学工具DREEP（DRug Estimation from single-cell Expression Profiles）将大规模体外药物筛选结果与单细胞数据联系起来。这项研究为依据肿瘤异质性确定细胞谱系组成和药物反应提供了一个框架。要想深入了解癌症如何开始、发展和获得治疗性耐药，就需要对癌症干细胞生物学进行更深入的探索。Charles P. Couturier等[20]利 用10xGenomics对55000个胶质母细胞瘤细胞和20000个正常脑细胞进行单细胞转录组测序，通过PCA和聚类非负矩阵分解（cNMF）开发了一种路线图技术，可以将每个肿瘤细胞投影到正常脑数据集上，研究分析表明，正常大脑发育协调了胶质母细胞瘤的发育，提示了胶质母细胞瘤层次的可能来源，并有助于识别癌症干细胞的特异性靶点。Qiming Zhang团队[21]结合10xGenomics和SMART-seq2单细胞转录组测序，对肝癌患者多个组织中免疫细胞进行了系统性的刻画，利用通过Monocle2算法以及全转录组扩散图谱对免疫细胞动态迁移和状态转化的特征进行分析，描绘了肝癌浸润免疫细胞跨组织的动态过程，对肝癌治疗有重要意义。Min Zhang等[22]对9例胃肿瘤和3例非肿瘤样本中27677个细胞进行了单细胞转录组分析，通过反复对TCGA中的上皮细胞肿瘤样本和正常配对样本做差异分析，得到恶性和非恶性上皮细胞。通过分化相关基因揭示了肿瘤内部和肿瘤之间分化程度高低的多样性，低分化度可预测胃癌的预后不良。Junya Peng等[23]通过10xGenomics对24个原发性胰腺导管腺癌病人样本及11个对照胰腺样本进行单细胞测序，发现具有独特增殖特征的导管细胞亚群与肿瘤浸润性T细胞的失活状态相关。此外大量研究表明肿瘤异质性是肿瘤细胞耐药性[24]的主要原因，耐药细胞在化疗过程中能够逐步取代对药物敏感的细胞，因此研究者需要深入探究肿瘤的异质性。总体来说单细胞测序的发展更有利于研究人员揭示肿瘤异质性，确定肿瘤生物学特征，也为肿瘤药物研发奠定了坚实的基础。

2 单细胞测序在肿瘤药物研发中的应用

单细胞测序为单个细胞的整个转录组进行采样提供了机会，从而将细胞处理成独立于表面标记或物种保护的细胞状态，并且对可用于分析的标记基因数量没有严格的限制[4]，单细胞测序技术可以有效评估药物治疗条件下肿瘤微环境中不同细胞分子间的动态变化，提供一个多维度的药效评价体系，包括用药前后细胞频率变化，细胞耐药性检测，关键通路和基因变化，联合治疗相性等。Krieg等[25]应用高维单细胞质谱流式技术分析黑色素瘤患者外周血中的免疫细胞亚群，发现单核细胞的数量可以成功预测PD-1抑制剂的治疗反应效果。Kathryn E. Yost等[26]在基底细胞癌和鳞癌患者中进行单细胞TCR测序，研究了PD-1治疗前后T细胞克隆种类的变化，结果发现PD-1抑制剂可以促进T细胞具备新的肿瘤抗原，并且促进新的T细胞进入肿瘤微环境。Zhuting Hu等[27]为揭示黑色素瘤患者体内的变化和机制，利用全外显子组测序（WES）和RNA测序表征了接种NeoVax疫苗前和接种疫苗后肿瘤样本的突变谱，发现NeoVax疫苗不仅诱导这些患者体内产生靶向目标新抗原的特异性T细胞，而且还扩展到识别其他与黑色素瘤相关的新抗原，从而起到一个持久抗肿瘤的效果。监测药物治疗反应可以揭示不同癌种不同病人的耐药机制，这对于寻找更新的免疫治疗靶点十分重要。单细胞测序允许我们追踪肿瘤细胞起源并比较肿瘤细胞对不同疗法的即时反应，大大加速了肿瘤药物反应以及肿瘤耐药性的研究，可以获得大量的致病基因以及可药用基因组靶标，单细胞测序的发展不仅可以从多角度丰富靶点容量，还可以更为精准的缩小靶点范围。Matthew T. Chang等[28]利用TraCe-seq追踪暴露于不同EGFR抑制剂靶向治疗后有反应和耐药的细胞，并进行差异基因分析和时间轨迹比较，发现抑制剂结合的EGFR引起的内质网应激对于实现完全疗效至关重要。深入了解抑制剂结合EGFR和内质网应激诱导的生化机制有助于将来开发靶向EGFR和其他膜相关蛋白的小分子药物。Yael C. Cohen等[29]通过MARSseq鉴定多发性骨髓瘤复发患者硼替佐米耐药途径和治疗靶点。通过对差异表达基因进行评分发现蛋白质折叠反应途径的核心酶肽基脯氨酰异构酶A（PPIA）是多发性骨髓瘤耐药的潜在治疗新靶标。利用CRISPR-Cas9敲除PPIA或使用小分子抑制剂（环孢菌素）抑制PPIA可使多发性骨髓瘤肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂敏感。这项工作确定了在临床试验中整合单细胞测序的路线图，确定了多发性骨髓瘤耐药患者的特征，并发现PPIA是这类肿瘤的有效治疗靶点。不同临床试验的结果差异提示，不同的化疗药物可能会导致不同的肿瘤微环境特征，进而影响免疫检查点抑制剂的治疗效果。Yuanyuan Zhang团队[30]通过10xGenomics单细胞转录组测序收集了来自22例TNBC患者（11例接受阿替利珠单抗联合紫杉醇化疗，11例接受紫杉醇单药化疗）治疗前和治疗后的78例配对样本。通过整合TCR测序和scATAC测序构建了TNBC患者肿瘤微环境和外周血中免疫细胞的高分辨转录组和表观组的动态图谱，发现肿瘤微环境富集中高水平的CD8-CXCL13+和CD4-CXCL13+ T细胞能够预测更好的联合治疗响应。

单细胞测序技术可以用于药物研发中的各个环节，目前研发抗肿瘤药物的一个关键方式是使用临床前动物模型[31]。虽然许多重要的发现都是通过临床前动物模型实现的，但是这些动物模型往往都是高度可变的，并且时常不能准确地概括人类肿瘤患者的反应。使用临床前动物模型的主要挑战是人和小鼠免疫系统之间可能存在的差异，因此将人类和小鼠的种群结构联系起来至关重要[32]，单细胞测序的发展为筛选更为合适的动物模型提供了机会。RapolasZilionis等[33]使用inDropscRNAseq对七名非小细胞肺癌（NSCLC）患者以及患有该疾病的模型小鼠和健康小鼠肺中的髓系细胞进行分析，并通过贝叶斯细胞分类器归类为相应的细胞类型。该项研究通过光谱聚类算法发现三种不同亚型的单核细胞以及四种不同亚型的树突细胞，这些亚型在人类和小鼠之间高度匹配，即在物种之间是保守的。然而巨噬细胞的九个亚群在人类和小鼠之间差异很大，显示出种间异质性。因此利用单细胞测序技术可以获得不同动物模型的细胞图谱，并将之与病人图谱进行比较，找出与患者肿瘤微环境特征相似的动物模型，从而用于正在开发的特定药物临床前研究。以上研究进展表明单细胞测序技术已经在药物研发中展现出巨大的潜力。

3 单细胞测序在药物筛选中的应用

药物筛选在药物研发中至关重要，但传统药物筛选过程工作量大且耗时耗力。细胞水平基因表达分析可以反映药物作用机制，高通量测序通过对基因表达进行测定可以筛选出大量的靶标药物，大大提高药物筛选的效率，促进新药的快速研发[34]。Chaoyang Ye等[35]分 析 了8种 剂 量 下433种 化合物处理的骨肉瘤U2OS细胞，并利用DRUGseq（Digital RNA with pertUrbation of Genes）对这些药物进行高通量筛选，得到细胞转录谱并根据其预期靶标药理作用机制（Mechanism of actions，MoAs）对化合物进行t-SNE聚类。同一簇中不同化合物的药理作用机制基本相同，进而可以推测出同一簇其他靶标化合物的药理作用机制。借助单细胞测序的药物筛选可以鉴定具有相似药理作用机制的化合物，并区分相关但不同的化合物，可以促进药物筛选和新药研发有效快速发展。Dongju Shin等[36]设计了一种多重scRNA-seq方法，该方法涉及带有独特细胞标记的条形码（barcode）和poly-A结构的单链寡核苷酸序列（SBO）的瞬时转染，以标记来自各种实验条件的样品。混合样本的药物治疗实验揭示了不同处理时间下基因表达轨迹，同时发现了药物作用下细胞的差异表达基因以及单细胞水平上特异性靶基因表达信号，这些实验结果为临床药物筛选提供实践依据，表明单细胞测序可在药物筛选中发挥重要的作用。SANJAY R.SRIVATSAN等[37]开发了一种名为sci-Plex的药物筛选新技术，这种技术使用多腺苷酸化单链寡核苷酸来标记细胞核，从而实现细胞散列和双峰检测。该技术可分析和定量响应成千上万种不同化合物的单细胞的基因表达，从而揭示药物对细胞所起的作用。随着高通量测序技术的出现使得获得大规模的抗体库多样性信息成为可能。单细胞BCR测序极大促进了抗体的发展，在传染病研究也有很多应用，通过单细胞BCR测序可以研究免疫系统对疫苗接种[38]的反应，单细胞BCR测序也可以用于寻找新冠病毒[39]的中和抗体。组织细胞通常具有异质性，特别是肿瘤细胞，传统的高通量测序样品由混合细胞组成，许多有价值的信息被均一化，不能充分展示群体中细胞对于药物的反应。以上研究成功表明，单细胞测序技术可以更加容易地完成这些分析，成为药物高通量筛选[40]强劲有效的工具。

4 总结与展望

肿瘤细胞的突变速率非常快，是一种高度异质性的群体。单细胞测序使人们能够在单个细胞水平上观测细胞类型的改变，以此来分析特定的细胞亚群变化，确定肿瘤组织中是否存在或存在哪些细胞亚群对化疗药物敏感，哪些细胞亚群处于免疫抑制状态，这些信息均有助于临床治疗，目前单细胞测序已被广泛应用于揭示各类疾病的免疫学特性[41,42]。通过对肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中恶性细胞，邻近间质细胞和免疫细胞之间复杂通信的描述，单细胞测序成为解决肿瘤异质性的有力工具[43]。不同肿瘤类型、相同肿瘤不同发展阶段、不同病人肿瘤微环境以及肿瘤细胞图谱均存在差异，这些原因导致大量病人无法从临床治疗中获益。目前抗肿瘤药物的研发路线主要集中在组织水平的分子特征，对药物靶向的细胞以及具体作用途径等机制缺乏透彻了解，因此限制了药物临床试验的成功率。如果获得了药物治疗前后靶细胞和作用途径的详细图谱，这将极大的促进抗肿瘤药物的研究进展。传统高通量筛选是现代药物发现的基础，但是无法针对体内各类不同细胞的作用途径和分子机制进行分析，无法评估药物对不同类别细胞的响应。单细胞测序技术对药物开发提供了新的视角，未来单细胞测序技术有望成为药物开发的重要工具。