罗 芳 卢玉梅 赵瑞斌 熊 根 范贤谋 朱恩槿 苏少明 陈敏 付旭宪
(1.昆明市公安局刑事科学技术研究所 云南 昆明 650500;2.昆明医科大学法医学院 云南 昆明 650500)
在爆炸案件中,爆炸残留物分析是爆炸原因调查和案件侦破的重要环节,可为侦查提供方向和线索,也可为证实犯罪事实、法庭诉讼和定罪量刑提供关键证据[1-2]。其中有机类炸药具有种类多、破坏能力强、危害性大、波及范围广、爆炸反应完全、现场样品残留量少、检材基质复杂,并且有机类炸药大都含有C、H、O、N等元素,具有热不稳定性、易发生热分解等特点,因此有机类炸药的检验分析也一直是法庭科学的难点。
有机炸药爆炸残留物分析技术包括光谱、色谱、质谱等技术。光谱法具有分析速度快、结果准确等特点,光谱分析中红外光谱、拉曼光谱是炸药鉴定的有力手段,仪器的小型化、便携化及信噪比和检出限的改善,都显著提高了光谱技术在爆炸分析中的实用性。应用光谱法对有机炸药进行分析时,红外光谱定性分析有机化合物具有鲜明的特征性。自然界中每一化合物都具有特异的红外吸收光谱,其谱带的数目、位置、形状和强度均随化合物及其聚集状态的不同而异,可根据化合物的红外光谱确定该化合物或官能团[3-4]。与传统的色谱和质谱方法相比,气体、液体及固态样品均可以进行红外光谱分析,具有样品前处理简单、操作方便等优点[5-6],通常一个样品的检测时间仅需2~3min左右,可实现对有机炸药纯品的快速检验[7]。有机炸药化学结构、官能团复杂,混杂成分较多,通常炸药爆炸之后,除了检测来自土壤中的爆炸残留物,还需要对皮肤组织等生物检材残留物进行检测[8],但红外光谱法灵敏度较低,对检测样品的量及纯度有一定要求,样品的纯度需大于98%,故只能应用于定性分析。红外光谱在爆炸残留物检验中最大的制约来自基质干扰,在实际爆炸案件中仅适合包装材料上未爆炸药颗粒的分析,不适用于尘土样品中爆炸残留物的分析。
色谱法分析中,气相色谱-质谱(GC-MS)技术结合气相较强的分析能力与质谱准确的定性能力,是对易挥发有机炸药检测的常用方法,适用于TNT等硝基芳香炸药的检验,而PETN的热不稳定性、HMX的低挥发性导致GC-MS分析比较困难。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术可以快速检测出复杂基质中的爆炸残留物,很好地避免了GC-MS检测炸药时发生的热分解现象,只要将炸药溶于溶液中便能进行检测。因此,LC-MS/MS适合分析强极性、热不稳定性、易发生热分解和高分子量的爆炸物,实现有机炸药爆炸残留物的高灵敏度分析[6,9-12]。在炸后残留物检验方面,炸药残留物很少且多以混合物的形式存在,在爆炸残留物的载体中,来自土壤、生物检材的基质干扰复杂,对仪器灵敏度和分辨率要求高。LC-MS/MS能避免有机炸药样品热分解的问题,检测难挥发的组分,同时还能对复杂基质的爆炸残留物进行检测[13-16],样品无需复杂的前处理,用有机溶剂甲醇提取、离心、过孔径0.22μm滤膜后直接进样经LC-MS/MS分析,定性、定量精确,灵敏度高,是理想的实验室检验技术。
虽然国内外针对爆炸残留物有机组分的检验均建立了相对成熟的技术方法,但据已有研究报道表明,单方法检验容易造成组分的误判或漏检,综合运用多种分析技术已经成为爆炸残留物分析技术的发展趋势[2]。本文拟采用LC-MS/MS结合红外光谱法,对硝化甘油(NG)、太安(PETN)、梯恩梯(TNT)、黑索金(RDX)、奥克托金(HMX)、特屈儿(CE)6种常见的有机类炸药,进行光谱检验技术和色谱检验技术联合应用检测,验证该检测方法的科学性和准确性。
甲醇(HPLC级购于美国Fisher Scientific公司);氯化铵(分析纯);100μg/mL硝化甘油甲醇溶液(标准品)、100μg/mL太安乙腈溶液(标准品)、100μg/mL梯恩梯丙酮溶液(标准品)、100μg/mL黑索金甲醇溶液(标准品)、100μg/mL奥克托金甲醇溶液(标准品)、100μg/mL特屈儿乙腈溶液(标准品),以上标准品均购于天津阿尔塔科技有限公司;实验用水为屈臣氏蒸馏水。
100μg/mL硝化甘油甲醇溶液、100μg/mL太安乙腈溶液、100μg/mL梯恩梯丙酮溶液、100μg/mL黑索金甲醇溶液、100μg/mL奥克托金甲醇溶液、100μg/mL特屈儿乙腈溶液等标准品置于-20℃避光保存,根据实验需要,用甲醇逐级稀释,供线性、检出限、基质效应、回收率等相关测试使用。
0.05mmol/L氯化铵水溶液的配置:称取2.67mg氯化铵固体,溶解后置于1000ml容量瓶中,用蒸馏水定容。
红外光谱仪:Spectrum Two IR—Spotlight 200i附件:Universal ATR(美国PE公司)
液相色谱质谱仪:1290/6470型液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent公司);高速离心机(美国Beckman公司);多管涡旋混合仪(上海一恒科技有限公司);电子天平(瑞士Mettle Toledo公司);JOYN-308超声波清洗机(上海乔跃电子科技有限公司);0.22μm有机微孔滤膜(天津津腾有限公司);移液器(美国Eppendorf公司)。
2.3.1 红外光谱分析条件
衰减全反射附件;扫描范围:400~4000cm-1;分辨率:4cm-1;扫描次数:32次。
2.3.2 液态样品的制备
采用压片法对液体样品进行制备:压制两片空白ZnSe片,取硝化甘油液体样品滴入一片上,再盖上另外一片,片的两外侧放上环形纸垫,用片剂框夹紧放入光路中,用于测定硝化甘油样品的红外吸收光谱。太安、梯恩梯、黑索金、奥克托金、特屈儿的压片操作方法同硝化甘油。
2.4.1 色谱条件
Agilent ZORBAX SB-C18(2.1mm×50mm,1.8μm)色谱柱,柱温30℃,进样量5μL,0.05mmol/L氯化铵水溶液(A相)—甲醇(B相)作为流动相,流速0.35mL/min,柱后平衡时间为1min,洗脱程序设定为梯度洗脱。流动相梯度洗脱条件如表1所示。
表1 流动相梯度洗脱条件
2.4.2 质谱条件
采用电喷雾离子化源,负离子模式,检测方法为多反应检测模式(MRM);干燥气温度300℃,干燥气氮气流速5L/min;鞘气温度250℃,鞘气流速11L/min;毛细管电压为:3500V,喷嘴电压:500V;喷雾器压力为45psi。根据以上条件优化质谱参数,得到6种有机炸药的定性定量分析离子对及碎裂电压、碰撞能量。MRM模式数据采集参数如表2所示。
表2 MRM模式数据采集参数
分别取适量6种有机炸药标准品用甲醇溶液配置成浓度为10μg/mL的混合储备液。取适量混合储备液配置成浓度为1μg/mL的混合标准工作液。取适量1μg/mL的混合标准工作液,用甲醇稀释配置低、中、高3个浓度水平的质控样品,浓度分别为5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。测定样品时,采用逐级梯度稀释方式,用甲醇将1μg/mL的混合标准工作溶液配置成1~100ng/mL的系列混合标准工作溶液。
2.6.1 混合标准样品分析
取适量1μg/mL的混合标准工作液,用甲醇稀释配置低、中、高3个浓度水平的质控样品,浓度分别为5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合标准液。
2.6.2 空白土提取液添加混标分析
称取现场附近空白泥土残留物10mg,加入10mL甲醇,振荡混匀后超声波超声15min,离心(9000r/min)5min后取上清液,将上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后,稀释50倍,成为空白基质储备液;取1μg/mL的混合标准工作液适量,用甲醇稀释配置低、中、高3个浓度水平的质控样品,浓度分别为10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL混合标准液;将空白基质液与10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL混合标准液以1:1比例进行稀释,得到提取后添加的5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合标准液。
2.6.3 添加混标的空白土提取液分析
称取现场附近空白泥土残留物5mg,加入5mL甲醇(10μg/mL6种有机炸药混合标准溶液)振荡混匀后,超声波超声15min,离心(9000r/min)5min后取上清液,将上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后,稀释100倍,所得为100ng/mL的混合标准液。
称取现场附近空白泥土残留物5mg,加入5mL甲醇(5μg/mL6种有机炸药混合标准溶液)振荡混匀后,超声波超声15min,离心(9000r/min)5min后取上清液,将上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后,稀释100倍,所得为50ng/mL的混合标准液。
称取现场附近空白泥土残留物5mg,加入5mL甲醇(500ng/mL6种有机炸药混合标准溶液)振荡混匀后,超声波超声15min,离心(9000r/min)5min后取上清液,将上清液经0.22μm膜过滤后,稀释100倍,所得为5ng/mL的混合标准液。
将2.3.1制备的液体样品压片在2.3红外光谱条件下进行红外光谱分析,硝化甘油、太安、梯恩梯、黑索金、奥克托金、特屈儿的红外谱图如图1~6所示。
图1 硝化甘油红外光谱图
图2 太安红外光谱图
图3 梯恩梯红外光谱图
图5 奥克托金红外光谱图
图6 特屈儿红外光谱图
表3 6种有机炸药的特征谱带信息
采用电喷雾电离方式,有机炸药多含有吸电子的含氮基团,热稳定性差、易分解,这类结构的化合物更容易失去质子形成[M-1]-离子,因而选择负离子扫描模式。多种目标物可加合不同负离子形成母离子,流动相缓冲盐的选择对目标物的检验具有重要影响。本文选择乙酸铵和氯化铵两种缓冲盐体系考察对目标物检验的影响,6种有机化合物通过脱氢或者加合缓冲盐负离子形成母离子。通过多次实验,确定采用氯化铵缓冲盐体系,梯恩梯母离子为脱离质子的[M-1]-离子,特屈儿母离子为[M]-离子,硝化甘油、太安、黑索金、奥克托金4种物质的母离子为加合离子[M+35CI]-离子。因为硝化甘油和梯恩梯具有相同的分子量,硝化甘油通过加合[35CI]-,梯恩梯通过脱H,两种物质也分别具有了辨别度的母离子。
在电喷雾电离负离子扫描方式下,分别取6种有机炸药1μg/mL单个标准工作溶液,对质谱条件进行优化。具体优化过程采用手动优化功能:第一步将1μg/mL单个标准工作溶液,进行母离子全扫描,设置扫描范围为200~380,根据加合离子[M-H]-、[M+35CI]-、[M]-确定各物质的母离子峰;第二步优化毛细管出口电压,从60v开始以5v为粗步长,然后以2v为细化步长确定每个物质的毛细管出口电压;第三步将母离子进入MS/MS分析,从信噪比、抗干扰等因素为选择依据,确定6种有机炸药的定量离子、定性离子;第四步优化碰撞能量,先以4ev为粗步长、然后以2ev为细步长,确定碰撞能量;第五步将实验数据代入多反应监测(MRM)得出6种有机炸药的QQQ条件。本文采用MRM模式能最大限度地排除各种杂质干扰,即使出现如化学性质相似或者分子量相同的化合物不能通过色谱完全分离的物质,也能通过MRM离子对对目标物进行确认。通过单个标准工作物质对毛细管电压、鞘气温度、鞘气流速、干燥器温度、干燥器流速和雾化器压力等影响质谱响应信号的离子源参数进行优化,得出6种有机炸药的质谱条件。
在优化好的质谱条件下,以1μg/mL的有机炸药混合标准工作液为分析对象,对在不同流动相(20mmol/L乙酸铵/水-甲醇、20mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸/水-甲醇、2mmol/L乙酸铵/水-甲醇、2mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸/水-甲醇、水-甲醇、0.05mmol/L氯化铵/水-甲醇)条件下进行考察,经过多次实验,不同浓度乙酸铵/水-甲醇体系及水-甲醇体系中,6种有机炸药的检验效果均不理想。6种有机炸药在0.05mmol/L氯化铵/水-甲醇洗脱条件下时,增强了质谱的响应强度,具有更低的检出限,检验效果显著提升。1μg/mL6种有机炸药混标图如图7所示;1μg/mL硝化甘油的色谱峰图如图8所示,对应的质谱图如图9所示;1μg/mL太安的色谱峰图如图10所示,对应的质谱图如图11所示;1μg/mL梯恩梯的色谱峰如图12所示,对应的质谱图如图13所示;1μg/mL黑索金的色谱峰图如图14所示,对应的质谱图如图15所示;1μg/mL奥克托金的色谱峰如图16所示,对应的质谱图如图17所示;1μg/mL特屈儿的色谱峰如图18所示,对应的质谱图如图19所示。
图7 6种有机炸药1μg/mL混标TIC色谱峰图
图8 1μg/mL硝化甘油TIC 和MRM色谱图
图9 硝化甘油质谱图
图10 1μg/mL太安TIC 和MRM色谱图
图11 太安质谱图
图12 1μg/mL梯恩梯TIC和MRM色谱图
图13 梯恩梯质谱图
图14 1μg/mL黑索金TIC和MRM色谱图
图15 黑索金质谱图
图16 1μg/mL奥克托金TIC和MRM色谱图
图17 奥克托金质谱图
图18 1μg/mL特屈儿TIC和MRM色谱图
图19 特屈儿质谱图
对配置的系列浓度1、5、10、20、50、100ng/mL的标准混合工作液,进行LC-MS/MS检出限、线性关系测试,配置的每个浓度平行6次实验。其中,线性关系以定量离子对峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标进行线性拟合;以信噪比大于等于3为标准,确定各有机炸药的检出限。经实验,太安、黑索金、特屈儿的检出限均为0.1ng/mL,硝化甘油、梯恩梯的检出限均为0.5ng/mL,奥克托金的检出限为0.75ng/mL。在1~100ng/mL线性浓度范围内,硝化甘油、太安、梯恩梯、黑索金、奥克托金、特屈儿6种有机炸药均具有良好的线性关系,硝化甘油的线性方程为y=87.276722x+92.158512,太安的线性方程为y=491.157136x-99.245705,梯恩梯的线性方程为y=12.652680x-13.505900,黑索金的线性方程为y=67.888191x-119.541643,奥克托金的线性方程为y=10.928863x-10.268980,特屈儿的线性方程为y=8.228976x-2.250067。实验结果表明,本方法具有良好的线性关系和较高的灵敏度,6种化合物相关系数R2均≥0.9990,检出限在0.1~0.75ng/mL范围内。6种化合物的线性范围、线性方程、相关系数R2及检出限结果如表4所示。
表4 6种有机炸药的线性参数和检测限
通过测定各目标化合物线性范围内低、中、高3个浓度质控样品的回收率和相对标准偏差(RSD)来考查方法的准确度与精密度,准确度用相对误差表示,精密度用RSD表示。按照配置低、中、高3个浓度的混合标样5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,每个浓度平行配置6份,依据测量的峰面积和线性方程,计算每个化合物的测量浓度,考查方法的准确性;取低、中、高3个浓度的混合标样,每个样品连续进6针,每个浓度同日内连续检测3次,根据各目标物定量离子对峰面积,计算日内精密度及相对误差;连续检测3日,计算日间精密度及相对误差。
实验结果表明:硝化甘油连续3日测定的相对误差(n=6)在-5.2%~9.33%之间,日内精密度(n=18)在2.7%~7.5%之间,日间精密度(n=18)在6.3%~12.8%之间;太安连续3日测定的相对误差(n=6)在-9.99%~1.8%之间,日内精密度(n=18)在1.4%~2.6%之间,日间精密度(n=18)在2.7%~5.6%之间;梯恩梯连续3日测定的相对误差在(n=6)在-1.95%~9.53%之间,日内精密度(n=18)在4.9%~12.2%之间,日间精密度(n=18)在11.3%~13.4%之间;黑索金连续3日测定的相对误差在(n=6)在-3.42%~8.25%之间,日内精密度(n=18)在7.9%~11.5%之间,日间精密度(n=18)在8.5%~11.6%之间;奥克托金连续3日测定的相对误差在(n=6)在-3.49%~1.2%之间,日内精密度(n=18)在2.6%~9.9%之间,日间精密度(n=18)在5.1%~11.4%之间;特屈儿连续3日测定的相对误差在(n=6)在-7.56%~9.0%之间,日内精密度(n=18)在5.0%~8.4%之间,日间精密度(n=18)在3.3%~10%之间。
总体来说,在精密度、准确度测试中,3个浓度的硝化甘油、太安、梯恩梯、黑索金、奥克托金、特屈儿相对误差在-9.99%~9.53%之间,日内相对标准偏差(RSD)均不大于12.2%,日间相对标准偏差(RSD)均不大于13.4%,证明方法的精密度和准确度良好,6种有机炸药的精密度及准确度如表5所示,完全可以满足6种有机炸药的分析鉴定工作。
表5 6种有机炸药的精密度及准确度
分别取空白标准液、提取前加标样本、提取后加标样本,按照配置低、中、高3个浓度的混合标样5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,每个浓度平行配置6份,每个样品连续进3针,根据提取后加标样本与空白标准液目标物定量离子对峰面积的比值计算基质效应,提取前加标样本与提取后加标样本目标物定量离子对峰面积的比值计算提取回收率。
实验结果表明:硝化甘油的基质效应在108.57%~109.67%之间,相对标准偏差在0.75%~0.81%之间,提取回收率在82.9%~99.05%之间,相对标准偏差在3.76%~6.15%之间;太安的基质效应在91.47%~98.21%之间,相对标准偏差在0.28%~1.53%之间,提取回收率在89.32%~98.99%之间,相对标准偏差在1.62%~3.17%之间;梯恩梯的基质效应在94.73%~96.87%之间,相对标准偏差在2.04%~13.34%之间,提取回收率在86.14%~99.57%之间,相对标准偏差在3.56%~6.16%之间;黑索金的基质效应在104.10%~113.92%之间,相对标准偏差在0.49%~2.96%之间,提取回收率在84.37%~99.83%之间,相对标准偏差在1.37%~6.69%之间;奥克托金的基质效应在108.79%~114.59%之间,相对标准偏差在2.58%~7.89%之间,提取回收率在91.99%~99.12%之间,相对标准偏差在3.92%~5.16%之间,特屈儿的基质效应在92.10%~97.82%之间,相对标准偏差在0.63%~2.82%之间,提取回收率在91.86%~94.92%之间,相对标准偏差在1.66%~5.12%之间。
总体来说,3个浓度的6种有机炸药的基质效应在92.1%~114.59%之间,RSD在0.49%~13.34%;提取回收率在82.9%~99.83%之间,RSD在1.37%~6.94%,证明方法的基质效应和提取回收率漂移不大,6种有机炸药的基质效应与提取回收率如表6所示,可满足6种有机炸药的分析鉴定工作。
表6 6种有机炸药的基质效应与提取回收率
2021年11月,昆明市某建筑工地发生爆炸案,经民警现场勘验,提取少许现场工地地面爆炸残留物及犯罪嫌疑人家里查获的1瓶黄色固体粉末送检。
取犯罪嫌疑人家中搜查到的炸药原体、工地现场地面爆炸残留物,研磨均匀后直接供红外光谱仪分析。称取爆炸案件犯罪嫌疑人家中搜查到的炸药原体、现场工地地面爆炸残留物各10mg,加入10mL甲醇,振荡混匀后超声波超声15min,离心(9000r/min)5min后取上清液,将上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后,稀释100倍,供LC-MS/MS分析。
采用本文所建立的LC-MS/MS结合红外光谱法,对爆炸现场提取的爆炸残留物和犯罪嫌疑人家中查获的爆炸物颗粒进行检验。分析结果显示,LC-MS/MS方法对爆炸残留物和炸药原体均能检出有机炸药TNT成分,而红外光谱法仅在炸药原体内检出有机炸药TNT成分,爆炸残留物中未检出TNT成分。样本红外光谱检测图谱如图20所示,样本LC-MS/MS检测色谱图如图21所示,质谱图如图22所示。
图20 爆炸物颗粒红外光谱图
图21 爆炸残留物色谱图
图22 爆炸残留物质谱图
本文所建立的LC-MS/MS方法准确度高、精密度好、回收率高,结合红外光谱法检验常见有机炸药,具有快速、准确、简便、高效等特点。采用的红外光谱检测技术不仅满足爆炸案件快速和准确定性的要求,而且通过LC-MS/MS技术以氯化铵作为流动相缓冲盐,利用每种化合物的MRM离子对,实现对硝化甘油、太安、梯恩梯、黑索金、奥克托金、特屈儿6种有机炸药成分的定性和定量分析。该检测方法完成了针对有机炸药从案发现场快速检测到实验室精确定性、定量分析的检测通路的构建,该方法可满足刑事案件中明确爆炸物类型、确定爆炸物种类等检测需要。两种检验方法的结合运用不仅可以避免组分的漏检,还可实现多种分析结果的相互佐证,保证检验结果的科学性和准确性,实现了对实际爆炸案件爆炸残留物等检材的快速、准确分析,可为案侦工作指明方向。