基于EPG技术的棉蚜抗性指标筛选

刘伟娇，李玲玉，高雪珂，张开心，李东阳，雒珺瑜，崔金杰*，杨 君*

（1.河北农业大学农学院，保定 071000；2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，安阳 455000）

棉花是我国重要的经济作物，棉蚜Aphis gossypiiGlover属于半翅目Hemiptera蚜科Aphididae，是棉花生产上主要害虫之一。棉蚜主要通过刺吸取食、排泄蜜露等途径为害棉花，使棉花生长发育受到严重影响[1-3]。同时由于其个体小、繁殖快、扩散能力强以及易产生抗性等特点，防治较为困难[4]，选育和种植抗蚜品种是进行蚜虫综合治理的重要措施之一。

刺探电位图谱（electrical penetration graph，EPG）技术是一种可以将刺吸式口器昆虫口针在寄主植物组织中复杂的刺探行为转变为不同波形电信号的电生理技术，是探索寄主植物与刺吸式口器昆虫之间隐秘的取食行为的有效手段[5,6]。目前，该技术在刺吸式口器昆虫取食行为[7-9]、昆虫与植物的互作关系[10]、害虫的传毒机制[11]、刺吸式口器昆虫的寄主专化型[12]等方面的研究中起到了越来越重要的作用。近年来，由于EPG参数具有可靠的稳定性和可操作性，并能用于高通量的检测，EPG技术逐渐应用于寄主植物对刺吸式害虫的抗性研究中[13]。但关于利用 EPG技术研究棉花对棉蚜抗性机制，探索可以判定棉花抗蚜等级指标方面的报道较少。

本研究通过室内生物测定棉蚜取食不同抗性等级苗期棉花的死亡率、产仔数等生物学特征来评估不同种质材料对棉蚜的影响，结合棉蚜在不同棉花品种上的EPG参数，分析了EPG各参数与生长发育参数的相关性，初步筛选可作为棉花对蚜虫抗性鉴定的主要EPG参数，以期为棉花抗蚜性鉴定方法提供重要的数据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

棉蚜采自中国农业科学院棉花研究所东场棉田，在室内用棉花中棉所49（CCRI 49）饲养繁殖多代（n＞30）后用于试验。

1.2 供试棉花品种

高抗材料：辽5632-642、TYJ-98-6、锦454、中G5；中抗材料：中棉所49（CCRI 49）、中棉所79（CCRI 79）、雷克斯（光叶）、非洲棉E-40；高感材料：辽棉6号。

以上材料均由中国农业科学院棉花研究所种质资源中期库提供。抗性水平参考刘旭明等[14]、芦屹等[15,16]、李进步等[17]、吕丽敏等[18]的研究结果和国家标准[19]。

1.3 棉蚜生物学测定

试验在人工智能光照培养箱内进行，条件：温度（26±1）℃，光周期14L∶10D，相对湿度70%～80%。将30头成蚜接到独立罩笼的中棉所49（常规品种）棉花叶片上，当其产仔时，移去成蚜，保留仔蚜继续饲养，待到仔蚜长为成蚜后用于试验。

采用在离体叶片上组建生命表的方法，将叶柄插入装有琼脂培养基的培养皿中，将1头无翅棉蚜成虫接到各个品种棉花叶片上，饲养2 d后开始试验。每天调查、记录存活虫量及产仔量，试验进行10 d。每培养皿为1次重复，每品种重复20次。每隔2 d更换1次叶片，保持叶片新鲜。

1.4 棉蚜刺吸电位试验

待棉苗长至真叶3叶期，选择体型大小基本一致的无翅成蚜用于试验。使用八通道直流型（DC-EPG Giga-8）（荷兰Wageningen University）刺吸电位仪来记录棉蚜口针取食EPG波形，用DI-720型（美国Dataq instruments，Inc）信号转换器来进行信号转换。数据采集过程参照汤清波等[20]。棉蚜在粘连金丝之后，对其进行1 h的饥饿处理。试验时，调整棉蚜在棉花叶片背面上的位置，使其具有一定的活动范围。随后接通电源，进行记录。记录时间为6 h，每头棉蚜只使用1次，每个处理取有效重复15～20次。

根据胡想顺等[5]和何应琴等[7]对蚜虫取食行为波形的划分，可将棉蚜在棉花上的取食波形分为以下几种。（1）C波：蚜虫口针在叶肉细胞间隙或韧皮部筛分子外部刺探；（2）Pd波：蚜虫口针刺破细胞膜时所测的膜内外电位差；（3）F波：蚜虫口针在叶片表面和细胞外部遇到机械阻力的波形；（4）E1波：蚜虫口针在韧皮部筛管内分泌唾液；（5）E2波：蚜虫口针在韧皮部筛管内部被动取食；（6）Np波：非刺探时期波形。

1.5 数据统计与分析

棉蚜在棉花上的生命表参数包括净增殖率（R0），平均世代时间（T）以及内禀增长率（rm），R0＝Σlxmx，T＝(Σxlxmx)/(Σlxmx)，rm＝lnR0/T，式中x为试验时间（d），lx为棉蚜在x时的存活率，mx为棉蚜在x－1到x时间内的每个重复产仔量，即每头棉蚜产仔量。棉蚜在棉花上的存活率以及生命表参数均用SPSS 17.0软件进行数据统计和差异显著性比较（Duncan’s法），差异显著性水平设为0.05。

EPG数据由style＋d软件转化成波形图谱，记录并保存；用分析软件style＋a对波形进行分析。将各EPG参数分类统计后，运用SPSS 17.0软件对棉蚜在不同棉花品种上的各EPG参数分别进行差异显著性比较（Duncan’s）和主成分分析（PCA），差异显著性水平设为0.05。

运用SPSS 17.0软件对EPG主要波形与棉蚜存活率、平均产仔数进行相关性分析（Pearson法），差异显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 棉蚜在棉花叶片上的存活与繁殖

2.1.1 存活率 棉蚜在3组间的生存情况存在明显差异。棉蚜在高抗品种“辽5632-642”、“锦454”上的存活率最低；高抗品种“TYJ-98-6”、“中 G5”和中抗品种“中棉所 79”上的次之；中抗品种“中棉所49”、“雷克斯（光叶）”、“非洲E-40”和高感品种“辽棉6号”上的棉蚜存活率最高，在80%以上；且差异达到显著水平（P＜0.05）。棉蚜在各品种间的净增殖率为：高抗品种“锦454”＜高抗品种“辽5632-642”、“TYJ-98-6” ＜高抗品种“中G5”、中抗品种“中棉所79”＜中抗品种“中棉所49”、“雷克斯（光叶）”、“非洲E-40”、高抗品种“辽棉6号”；其中以“辽棉6号”上的棉蚜净增殖率最高，达到36.10；且差异显著（P＜0.05）。平均世代时间在高抗品种“辽5632-642”、“锦454”上最低；在中抗品种“中棉所49”、“中棉所79”、“非洲E-40”上次之；在高抗品种“TYJ-98-6”、“中G5”和中抗品种“雷克斯（光叶）”、高感品种“辽棉6号”上最高；且差异显著（P＜0.05）。各品种上的棉蚜平均世代在 4.84～6.42 d，各组间无明显规律。棉蚜的内禀增长率在高抗品种“辽 5632-642”、“TYJ-98-6”、“中G5”上最低，均低于52%；在高抗品种“锦454”、中抗品种“雷克斯（光叶）”和高感品种“辽棉6号”上次之；在中抗品种“中棉所49”、“中棉所79”、“非洲E-40”上最高；且差异显著（P＜0.05）。棉蚜在这3组抗性品种上均表现为rm＞0且R0＞1，可以产仔的成蚜多，且产仔量大，为增长型种群，即棉蚜可以在田间这几种棉花品种上建立种群，但在高感品种上棉蚜的种群存活数量更多且扩繁能力更强（表1）。

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2.1.2 繁殖率 在高抗品种“辽5632-642”和“锦454”上的棉蚜平均产仔数最少，均低于20头；在高抗品种“TYJ-98-6”和“中G5”上次之；在中抗品种和高感品种上最多；且差异达到显著水平（P＜0.05）。高抗品种上的棉蚜产仔数个体差异较大，中抗品种上的棉蚜产仔数差异较小（图1）。

图1 棉蚜在各品种棉花上的平均产仔数Fig.1 The average number of offspring with A.gossypii on various cotton varieties

2.2 棉蚜在棉花叶片上的取食行为

2.2.1 棉蚜口针在韧皮部之外的刺探行为 9个棉花品种上的Np、C、Pd波和F波见表2。6 h内棉蚜在高抗品种（辽5632-642、TYJ-98-6、锦454和中G5）上的Np波总时间与总次数最多，中抗品种（中棉所49、中棉79和雷克斯（光叶））上的次之，中抗品种非洲棉E-40和高感品种辽棉6号上的最少，差异均达显著水平（P＜0.05）。

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C波总时间与总次数在中抗品种非洲棉E-40和高感品种辽棉6号，尤其是辽棉6号上的最多，其他3个中抗品种上的次之，4个高抗品种上的最少，且3组之间差异显著（P＜0.05）。高感品种辽棉6号上的C波平均时间最长，达到每次0.57 min。

4个高抗品种与中抗品种雷克斯（光叶）上的Pd波总时间与总次数最多，均达到30 min和300次以上；中抗品种中棉所49与中棉所79上的次之；中抗品种非洲棉E-40和高感品种辽棉6号，尤其是辽棉6号上的最少。中抗品种非洲棉E-40上的Pd波平均持续时间最长，高抗品种TYJ-98-6上的次之，其他品种上的时间最短且差异不显著（P＞0.05）。

在高抗品种锦454上的F波（＞10 s）总时间、F波（＞10 s）总次数和F波（＞10 s）平均持续时间均最多，且与其他品种差异极显著（P＜0.01）；高感品种辽棉6号上的则最少。各品种间存在F波（＞10 s）的个体比例，在4个高抗品种与3个中抗品种（中棉所49、中棉79和雷克斯（光叶））多，但差异不显著；在中抗品种非洲棉E-40和高感品种辽棉6号中少，且均低于30%。两类之间差异极显著（P＜0.01）。

2.2.2 棉蚜口针在韧皮部取食的刺探行为 E1波的长短反映植物韧皮部对蚜虫取食的抗性程度的高低，E1波长，植物抗性水平高。由表3可见，在4个高抗品种上，第1次E1波出现时间显著晚于其他品种，而在高感品种辽棉6号上最早出现E1波形。4个高抗品种上第1次E1波持续时间最长，E1波总时间最长且总次数最多；3个中抗品种（中棉所49、中棉79和雷克斯（光叶））上的次之；中抗品种非洲棉E-40和高感品种辽棉6号上的最少。4个高抗品种上E1波平均持续时间＜3个中抗品种（中棉所49、中棉79和雷克斯（光叶）＜中抗品种非洲棉E-40和高感品种辽棉6号，且差异显著（P＜0.05）。

E2波出现的早晚及持续时间说明昆虫对植物韧皮部汁液的喜好程度。在高感品种辽棉6号上最早出现E2波形，4个高抗品种上最晚出现E2波（表3）。高感品种辽棉6号上的第1次E2波持续时间最长，中抗品种非洲棉E-40次之，其他品种上的时间最短，但差异不显著（P＞0.05）。E2波出现的总时间、总次数在4个高抗品种上显著低于其他品种，但E2波平均持续时间较长。4个高抗品种上的E波总时间和E2波占整个E波的比例，显著低于其他品种。

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2.2.3 棉蚜在棉花上取食的EPG参数主成分分析 对28个EPG参数做了主成分分析（图2）。所有指标来分类品种，只能涵盖78%的品种数（图2A）。所以，我们根据各个成分的贡献度和变异系数，得到Np波总次数、E1波总次数、第1次刺探出现时间、第1次E1波持续时间和第1次E2波出现时间5个主要参数，再次对品种进行了分类，结果可以涵盖94%的品种数（图2B），同时这5个EPG参数在4个高抗品种、3个中抗品种（中棉所49、中棉79和雷克斯（光叶））和高感品种间均差异显著（P＜0.05），这说明我们选择的主要参数是可行的，Np波总次数、E1波总次数、第1次刺探出现时间等5个EPG参数，是用来品种分类的重要指标。

图2 棉蚜在9个棉花品种上取食的EPG参数主成分分析Fig.2 Principal component analysis of EPG parameters of A.gossypii feeding on 9 cotton varieties

2.3 主要EPG参数与棉蚜存活率、平均产仔数相关性分析

对主要EPG参数与棉蚜存活率、平均产仔数的相关性分析（表4），发现5个主成分EPG参数Np波总次数、E1波总次数、第1次刺探出现时间、第1次E1波持续时间和第1次E2波出现时间和棉蚜的存活率、平均产仔数显著相关（P＜0.05），甚至Np波总次数、第1次E1波持续时间和第1次E2波出现时间这3个参数与棉蚜的存活率、平均产仔数均达到极其显著相关的程度（P＜0.01）。所以我们可以确定这5个EPG参数是室内棉花抗蚜等级鉴定的重要指标。

表4 主要EPG参数与棉蚜存活率、平均产仔数的相关程度（P值）Table 4 Correlation between main EPG parameters and survival rate and average litter size of A.gossypii (P)

3 讨论

目前，对棉花抗蚜等级的鉴定主要是靠田间试验与虫情调查，田间抗蚜性的研究较多[21]，而在室内和苗期鉴定棉花种质材料抗蚜特征的报道较少。本文通过研究室内不同抗性等级棉花上棉蚜的生长发育，初步明确了不同抗蚜棉花材料上棉蚜的生长发育存在差异。研究结果表明，棉蚜在高抗、中抗和高感3组品种间的生存发育情况存在明显差异。棉蚜在高抗品种上的存活率普遍较低，中抗品种上的次之，高感品种上的棉蚜存活率最高。高抗品种上的棉蚜净增殖率、内禀增长率和平均产仔数均较低，而中抗品种和高感品种上的数据差异不显著。平均世代时间在各个品种间无显著差异。该结论与薛丽等[22]、马超等[23]、李海强等[24]在棉蚜生命表构建上的研究结果基本一致。

植食性刺吸式口器昆虫在植物表面刺探或取食时，其口针可以探测到包括植物表面和组织内部的物理和化学信息，从而产生不同的取食行为。EPG技术作为一种研究刺吸式口器昆虫摄食行为的电生理技术，其应用之一就是可以通过比较昆虫在不同作物品种上的刺探过程，判断植物是否含有抗虫特征[13]。与田间调查鉴定抗虫等级相比，EPG技术具有周期短、简捷方便、受干扰小等特点[5]。在室内可控的条件下，选择合适的EPG参数，对植物的抗虫级别进行划分，快速筛选抗性植物已经是植物抗性研究方面的热点[13]。选择具有代表性的EPG参数为指标，对大批量的植物材料进行归类，可以大致判断其抗性强弱。本文研究了棉蚜在不同品种棉花叶片上的取食行为，分析了EPG各参数在不同等级棉花材料上的差异。

结果表明，在高感品种辽5632-642、TYJ-98-6、锦454和中G5中，棉蚜在叶片上经常长时间的爬行或停息，首次尝试刺探意愿低，多次刺探且持续刺探时间长，口针经常出现回撤与频繁穿刺现象；鲁卓越等[25]在蚜虫取食过程中也发现了这种现象；表明这4个品种的叶肉组织不是棉蚜的适宜取食位点。尽管棉蚜在其韧皮部每次吸食的时间较长，但由于某种原因仍不能停留此部位连续取食；这种现象与赵曼等[26]在 2015年对玉米蚜的取食行为研究中的结果基本一致；这表明叶肉组织和韧皮部均可能存在抗蚜因子。棉蚜低频率短时间的取食叶片汁液，口针在叶片表面遇到较强的机械阻力，这可能与棉花叶片存在茸毛，细胞壁厚等对口针起到了机械障碍作用有关；郭建国等[27]在蚜虫取食不同抗性表型燕麦上的取食行为的研究中做了类似的描述；这说明抗蚜因子也可能存在于叶片表面。棉蚜口针较晚到达叶片韧皮部且分泌唾液，在韧皮部被动吸食时间短，口针活动的时间长、次数多，表明棉蚜在这4个品种上需要多量、多次分泌唾液才能保证其顺利吸食；这与郭建国等[27]的研究中的结果相一致；这些现象说明这4个品种对棉蚜的抗性水平相对较高。在中抗品种中棉所49、中棉所79和雷克斯（光叶）中，棉蚜在叶片上低频率较长时间的爬行或停息，口针在叶片表面遇到较弱的机械阻力，这3种品种均为光叶无茸毛材料，这证明茸毛少甚至无茸毛的材料更利于蚜虫的滋生；这与刘旭明等[14]、芦屹等[15,16]、李进步等[17]、吕丽敏等[18]在田间鉴定棉花种质材料的抗蚜等级的结果相一致。在中抗品种非洲E-40和高感品种辽棉6号中，棉蚜在叶片上几乎没有爬行或停息的阶段，接触棉花叶片后即产生刺探意愿，刺探次数少且几乎不会持续刺探，口针在同一部位停留时间长，很少出现回撤与频繁穿刺的现象。同时高频率长时间的取食叶片汁液，这表明棉蚜喜欢吸食这2个品种的叶肉细胞汁液。棉蚜口针在叶片表面几乎没有遇到机械阻力，这表明这2个品种的抗蚜因子很小程度上位于叶片表面。棉蚜口针顺利的到达其叶片韧皮部，低频率的分泌唾液，被动吸食时间长，这表明这2种棉花品种韧皮部几乎没有抗蚜因子的存在。这些现象说明这2个品种对棉蚜的抗性水平相对较低。赵曼等[26]在对玉米蚜取食行为研究中也得出了类似的结论。而棉蚜在中抗品种非洲 E-40上的取食行为变化介于其他中抗品种与高感品种之间，这个结果的产生可能与棉花种质材料本身对EPG技术的适合度、种质材料的变异、试验环境各异等因素有关。

通过对9种棉花材料上棉蚜EPG参数与棉蚜存活率、平均产仔数进行相关性分析，结果显示，5个主成分EPG参数Np波总次数、E1波总次数、第1次刺探出现时间、第1次E1波持续时间和第1次E2波出现时间和棉蚜的存活率、平均产仔数均达到显著相关的程度，这5个EPG参数与棉蚜生理学特征相一致。

利用刺吸电位仪记录并进而比较、分析了棉蚜在9个田间抗蚜水平表现不同的棉花品种上的刺探、取食行为，结果显示在室内鉴定的棉花抗蚜等级与在田间鉴定的抗蚜等级相一致。同时结合棉蚜在棉花叶片上的存活率、平均产仔数，筛选出5个主要的EPG参数，可作为棉花对蚜虫抗性的评价指标，探索了抗蚜指标建立的思路，对室内棉花抗蚜等级鉴定方法进行初步定性。