响应面法优化超声波辅助提取锥栗壳色素工艺研究

黄庆斌，任 俊，黄 艳

（1.福建林业职业技术学院，福建 南平 353000；2.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300）

锥栗（Castanea henryi Rehd.et Wils） 属山壳斗科植物，别名毛榛、尖栗、为落叶乔木[1]。锥栗外壳亮丽，营养价值高，富含碳水化合物、蛋白质和脂肪等。据《本草纲目》记载，锥栗具有治腰脚不遂、内寒腹泻、补肾益气等功效。在我国，锥栗种植于闽、浙、赣、川等地，闽北建瓯市被称为“锥栗之乡”，种植面积广、产量高、品种齐全[2-4]。对锥栗果实的开发利用已被广泛关注，而大部分锥栗壳被焚烧或废弃，不仅造成资源浪费，而且极易造成环境污染[5]。锥栗壳不仅能去皱、止血，毛球具有消肿等功能，而且富含天然色素——棕色素等[6]。据统计，建瓯锥栗产量达3.3万t/年，产值超过4.61亿元，锥栗壳可达1.85万t[7]，这为锥栗壳棕色素的提取提供了原料保障。

色素分为天然色素与合成色素[8-10]，合成色素与天然色素相比着色力强、性质稳定、价格便宜等优点。研究表明，几乎所有的合成色素都无法提供人体所需的营养素，有些合成色素的安全性受到质疑，被严格限制使用[11-13]。天然色素因其无副毒作用、安全性高等优点被人们所追捧，在市场上以每年保持10%以上的速度增长[14]。

在我国目前有34种色素已被批准允许在食品行业中使用。欧美发达国家非常注重对天然色素的开发和利用[15-16]。近年来，随着经济发展、行业标准提高，食品饮料行业对色素的需求也随之增长，天然色素是未来色素发展的主要趋势[17]。

超声波提取技术（Ultrasonic extraction）是利用超声波的机械、空化、热效应等物理破碎方法来完成生物有效成分的提取[18]，该过程不会改变浸提物化学成分的结构和性质[19]。超声波辅助技术在食品有效成分提取方面有广阔的应用前景[20]。

国内科学家对锥栗栽培[21-22]、生理特性[23]、加工贮藏[24]等方面的研究较多，对锥栗壳的有效利用研究不多见。以碳酸钠溶液为溶剂，应用超声波辅助浸提，探究超声时间（A）、超声温度（B）、超声功率（C）、料液比等因素对锥栗壳色素提取的影响，再通过响应面法优化提取工艺参数，以期为锥栗壳天然色素开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

锥栗壳，市售，经筛选除去霉烂，清洗晾晒至干，将贴壳带绒毛果衣去除，然后置于60℃烘箱中24 h，再粉碎过100目筛，备用[5]。

碳酸钠（AR），西陇化工股份有限公司提供；无水乙醇（AR），三明市三圆化学试剂有限公司提供。

DZF-6050型真空干燥箱，扬州市培英实验仪器有限公司产品；RE52-99型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；SartoriusBSA2245型电子分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司产品；HH-S4型数显恒温水浴锅的，河北中捷仪器制造有限公司产品；DHF-9123型电热恒温鼓风千燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品；PW80型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；KQ-520ODE型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司产品；UV-3200PC型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 锥栗壳粗提色素的制备

参考陈世平[4]的方法，稍作调整，工艺如下：

锥栗壳粉→乙醇恒温回流浸提→抽滤、离心→减压浓缩→粗提液→加乙醇、乙酸乙酯及石油醚萃取除杂→减压浓缩→冷冻干燥→粗提色素干品。

1.2.2 绘制标准曲线

称取5.00 mg锥栗壳粗提色素于100 mL容量瓶中，加质量分数为2.5%的Na2CO3溶解定容，得质量浓度为0.05 mg/mL的标准溶液。分别吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL标准溶液于5支10 mL具塞试管中，依次向试管中加质量分数为2.5%的Na2CO3溶液9.0，8.0，7.0，6.0，5.0 mL定容至刻度，于最大波长277 nm处[5]测定吸光度，以质量浓度和吸光度为横、纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 提取率计算[25]

式中：C——锥栗壳色素溶液质量浓度，mg/mL；

V——锥栗提取液体积，mL；

W——锥栗壳粉质量，g。

1.2.4 单因素试验

（1）Na2CO3溶液对锥栗壳色素提取的影响。称取1.000 0 g锥栗壳粉6份，分别装入6个250 mL锥形瓶中，按料液比1∶30（g∶mL）加入质量分数分别为3.0%，2.5%，2.0%，1.5%，1.0%，0.5%的Na2CO3溶液30 mL，在超声温度为40℃，超声功率为450 W浸提20 min，抽滤后以转速5 000 r/min离心15 min。取1 mL上清液稀释至100 mL，于波长277 nm处测定吸光度。

（2）超声功率对锥栗壳色素提取的影响。称取1.000 0 g锥栗壳粉6份，分别装入6个250 mL锥形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入质量分数为1%的Na2CO3溶液30 mL，于超声温度为40℃，分别置于超声功率为500，450，400，350，300，250 W下浸提20 min，抽滤后操作同前文。

（3）超声温度对锥栗壳色素提取的影响。称取1.000 0 g锥栗壳粉6份，分别装入6个250 mL锥形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入质量分数为1%的Na2CO3溶液30 mL，在超声温度分别为80，70，60，50，40，30℃，超声功率为450 W条件下浸提20 min，抽滤后操作同前文。

（4）超声时间对锥栗壳色素提取的影响。称取1.000 0 g锥栗壳粉6份，分别装入6个250 mL锥形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入质量分数为1%的Na2CO3溶液30 mL，于超声温度为40℃，超声功率为450 W条件下，分别浸提10，20，30，40，50，60 min，抽滤后操作同前文。

（5）料液比对锥栗壳色素提取的影响。称取1.000 0 g锥栗壳粉6份，分别装入6个250 mL锥形瓶中，在料液比分别为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）加入质量分数为1%的Na2CO3溶液30 mL，于超声温度为40℃，超声功率为450 W条件下浸提20 min，抽滤后操作同前文。

（6）提取次数对锥栗壳色素提取的影响。称取1.000 0 g锥栗壳粉6份，分别装入6个250 mL锥形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入质量分数为1%的Na2CO3溶液30 mL，于超声温度为40℃，超声功率为450 W条件下浸提20 min，分别提取1，2，3，4次，抽滤后操作同前文。

1.2.5 Box-benhnken试验设计

选取提取次数1次、Na2CO3质量分数2.5%，料液比1∶30，以锥栗壳色素提取率为响应值，以A、B、C为自变量，优化Box-behnken试验设计，试验重复3次以上。

因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计

1.2.6 验证试验

将响应曲面软件回归模型预测值与验证试验结果比较，考查其拟合度，确定模型的可靠性和实际意义。

1.2.7 数据处理

单因素图用Excel 2013绘制，采用Design Expert 8.0.6软件建立回归模型、绘制响应曲面图并进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

锥栗壳色素标准曲线见图1。

图1 锥栗壳色素标准曲线

以质量浓度、吸光度为横、纵坐标，得回归方程：

式中：A——吸光度；

C——色素质量浓度，mg/mL。

由图1可知，锥栗壳色素质量浓度为0.005～0.025 mg/mL时，吸光度与质量浓度线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 Na2CO3溶液对锥栗壳色素提取的影响

Na2CO3溶液对锥栗壳色素提取的影响见图2。

图2 Na2CO3溶液对锥栗壳色素提取的影响

由图2可知，Na2CO3溶液质量分数较低时，提取率与Na2CO3溶液呈正相关，当质量分数为2.5%时，提取率为14.18%，为最大值；之后随质量分数增加，色素提取率有所下降，可能过高的Na2CO3溶液质量分数对色素结构有一定的破坏[26]。因此，选取Na2CO3为2.5%开展下一步试验。

2.2.2 超声功率对锥栗壳色素提取的影响

超声功率对锥栗壳色素提取的影响见图3。

图3 超声功率对锥栗壳色素提取的影响

由图3可知，超声功率小于450 W时，提取率与超声功率呈正比；当超声功率为450 W时，提取率达到32.15%，为最大；超声功率大于450 W时，提取率随超声功率的增大而降低，可能是较强的热效应使色素加快分解，致使提取率下降[27]。因此，选取超声功率为450 W开展下一步试验。

2.2.3 超声温度对锥栗壳色素提取的影响

超声温度对锥栗壳色素提取的影响见图4。

图4 超声温度对锥栗壳色素提取的影响

由图4可知，提取率随超声温度的升高而提高，当超声温度为80℃时，提取率最大，为37.07%。超声温度继续升高提取率下降，可能是到一定温度时色素分子降解加快，使其提取率降低[27]。因此，选取超声温度80℃开展下一步试验。

2.2.4 超声时间对锥栗壳色素提取的影响

超声时间对锥栗壳色素提取的影响见图5。

由图5可知，提取率与超声时间的关系是先呈正相关而后呈负相关，当超声时间40 min时，提取率最大，为38.47%。超声时间继续增加，其空化效应增强可能会破坏部分色素结构，使其提取率降低[28]。因此，超声时间40 min为最佳。

图5 超声时间对锥栗壳色素提取的影响

2.2.5 料液比对锥栗壳色素提取的影响

料液比对锥栗壳色素提取的影响见图6。

图6 料液比对锥栗壳色素提取的影响

由图6可知，当料液比达1∶30（g∶mL）时，提取率最大，为38.66%，之后提取率趋于平稳；可能是料液比增加提取液在色素细胞内的扩散增强，但提取液浓度低于一定程度时，渗透压变大，扩散能力反而降低[29]。为节约耗材、降低成本，宜选用料液比1∶30（g∶mL）。

2.2.6 提取次数对锥栗壳色素提取的影响

提取次数对锥栗壳色素效果的影响见图7。

图7 提取次数对锥栗壳色素效果的影响

由图7可知，锥栗壳色素提取率随着提取次数的增加而呈上升趋势，但上升不明显。为提高效益，选用1次提取。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 建立回归模型响应面试验设计及结果见表2。

利用Design Expert 8.0.6软件对表2中的响应面值开展回归分析，得锥栗壳色素提取率与A、B、C的二项多元回归方程为：

表2 响应面试验设计及结果

2.3.2 方差分析

二项多元回归方程的方差分析见表3。

表3 二项多元回归方程的方差分析

由表3可知，模型F值为2 347.59（p＜0.000 1），说明该模型有极显著差异；失拟项p=0.072 1＞0.05，说明无显著差异、误差小，拟合度高；R2=0.971 2，表明97.12%的响应值变化能够用该模型解释，该模型不能解释剩余2.88%的变异值。各因素对锥栗壳色素提取效果影响程度为A＞B＞C，即超声时间＞超声温度＞超声功率。表4显著性可知，A、A2，B2，C、C2均有极显著影响（p＜0.000 1），交互项AC、BC这2个因素有显著影响（p＜0.05），其他因素无显著影响（p＞0.05）。

2.3.3 锥栗壳色素提取率响应曲面

经Design Expert 8.0.6软件分析，图8～图10为试验所得响应面图。

超声时间和超声功率的交互作用对锥栗壳色素提取的影响见图8。

图8 超声时间和超声功率的交互作用对锥栗壳色素提取的影响

由图8可知，A和C的交互作用的等高线图为椭圆形，说明AC交互作用对锥栗壳色素提取率有显著影响。当超声功率固定时，色素提取率随超声时间的延长，呈先增后减的趋势，提取率达最大值出现在40 min时。

超声温度和超声功率的交互作用对锥栗壳色素提取的影响见图9。

图9 超声温度和超声功率的交互作用对锥栗壳色素提取的影响

由图9可知，B与C交互作用的等高线图为椭圆形，表明BC交互作用对锥栗壳色素的提取率有显著影响。当超声温度一定时，色素提取率随超声功率的增加呈先增后降的趋势，最大值出现在超声功率为450 W时。

超声时间和超声温度的交互作用对锥栗壳色素提取的影响见图10。

图10 超声时间和超声温度的交互作用对锥栗壳色素提取的影响

由图10可知，AB交互作用等高线图为椭圆形，说明AB交互作用对锥栗壳色素提取率有显著影响。超声温度达到80℃时，提取率最大，之后随超声温度和超声时间增加，提取率均呈下降。

2.4 参数优化及验证

对试验数据用Design Expert 8.0.6软件进行优化，得超声波辅助Na2CO3溶液提取锥栗壳色素的最佳工艺参数为超声时间47.1 min，超声温度81.38℃，超声功率445 W，理论提取率为39.177 9%。为优化工艺参数操作性，修正为超声时间47 min，超声温度81℃，超声功率450 W，用修正后的参数做验证试验，测得提取率为38.41%，两者相对误差约为0.77%。由此表明，试验优化的方程具有实践意义，利用该数学模型对优化锥栗壳色素提取工艺是可行的。

3 结论

利用Design Expert 8.0.6软件中Box-behnken功能，设计超声时间、超声温度、超声功率与锥栗壳色素提取率之间的数学模型为：

相关系数R2=0.971 2，p=0.072 1，说明数学模型显著，拟合度高。

利用该模型的响应面，讨论了影响锥栗壳色素提取率的关键因素及其相互作用，优化得出最佳工艺参数为超声时间47.2 min，超声温度81.39℃，超声功率450 W，此工艺条件理论预测值（39.18%）与修正工艺后的验证结果（38.41%）间的相对误差约为0.77%，说明该模型合理，对指导实践有一定作用。