杠香乙醇提取物对小鼠急性毒性实验研究

何金美，张丹雁，范紫颖，孙楷填

（1.广州中医药大学第三附属医院药学部，广东 广州 510360；2.广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

杠香，又名龙肝香、藤沉香、云香，为豆科蝶形花亚科黄檀属植物滇黔黄檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）含树脂的根、根茎及藤茎，主产于云南、贵州、四川等地，东南亚地区亦有分布。杠香在民间有着悠久的药香两用历史，西南少数民族地区习用杠香泡茶、浸酒，单方或组方内服用于治疗感冒、咳喘、急慢性胃肠炎等，外用治疗皮肤溃疡、刀伤、烧烫伤等[1，2]。此外，杠香木质致密，香气诱人，常用作熏香或雕刻艺术品流行于香料文玩市场，综合开发利用前景十分广阔。现代研究表明，杠香含有挥发油、糖类、有机酸类、黄酮类等成分，并具有抗氧化等药理活性[3]。林如意等[4]采用纸片扩散法对杠香的4 种提取物进行了抗菌活性研究，结果表明杠香4 种提取物对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）均显示不同程度的抑菌效果。由于杠香目前仅限于我国西南民间地区进行药用，未进行系统的药理药效研究，本研究将参照《药物单次给药毒性研究技术指导原则》[5]对杠香进行急性毒性研究，为后续毒理药效等研究提供参考依据，促进黄檀属药用植物新资源的开发。

1 材料与仪器

1.1 材料来源 杠香，产自云南省，由广州中医药大学张丹雁鉴定其来源于豆科黄檀属植物滇黔黄檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）含树脂的藤茎，样品保存于广州中医药大学中药学院中药鉴定实验室。

1.2 实验动物 SPF 级昆明种健康成年小鼠30 只，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2013-0034；体重18～22 g，雌雄各半，分笼适应性饲养1 周；饲养环境温度20 ℃～25 ℃，相对湿度45%～70%，光照以12 h 为周期明暗交替。

1.3 仪器与试剂 DS-1500A 分析天平（佛山市拓普域电子有限公司）；脱水机、包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；正置光学显微镜（Nikon Corporation）；多聚甲醛、无水乙醇、二甲苯、中性树胶、H&E 染液、分化液、返蓝液（国药集团化学试剂有限公司）；以上试剂均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 杠香乙醇提取物的制备 取干燥杠香样品适量，粉碎机粉碎后过100 目筛，称取过筛后的杠香粉末20 g 置于圆底烧瓶中，根据预实验结果，按照液料比1∶10，提取时间2 h，提取温度80 ℃，乙醇浓度60%，进行水浴回流提取，重复提取2 次，合并滤液，减压浓缩成浸膏，冻干成粉，收集得到干燥固形物1.516 g，本品提取率为7.58%，即1 g 提取物相当于生药材13.19 g，干燥环境下密封保存备用，使用时以蒸馏水配制成所需浓度的混悬液。

1.4.2 预实验 SPF 级昆明种小鼠10 只，雌雄各半，实验前禁食不禁水6 h，以能通过灌胃针的最大浓度醇提物折合生药材为1.06 g/ml 为给药剂量，按照小鼠体重，以0.4 ml/10 g 计算最大给药体积，一次性灌胃给药，连续密切观察14 d，结果小鼠状况良好，无一死亡，无法计算半数致死量（LD50），故正式实验采用最大给药量法[6-9]进行。

1.5 杠香乙醇提取物对小鼠的急性毒性实验 SPF级昆明种小鼠20 只，雌雄各半，实验前禁食不禁水6 h，随机分为空白组和杠香组，每组雌、雄各5 只，分笼饲养。依据预实验结果以能通过灌胃针的最大浓度醇提物折合生药材为1.06 g/ml 为给药剂量，按照小鼠体重，以0.4 ml/10 g 计算最大给药体积，一次性灌胃给药，空白组给予同等体积的蒸馏水。给药后6 h 内密切观察小鼠的行为状态，4 h 后给予充足的食物和饮水。

1.6 观察指标

1.6.1 动物一般状态观察 给药结束后第2 天起，每天密切观察小鼠，连续观察14 d，期间给予小鼠充足的饮水和食物，以《药物单次给药毒性研究技术指导原则》[5]中的一般观察指征为标准。于实验前及给药后第3、6、9、12、14 天对小鼠体重及总进食量进行记录。若小鼠中途死亡，及时取出解剖观察病变情况。

1.6.2 动物脏器取材及观察 观察期结束后颈椎脱臼处死所有小鼠，迅速解剖，肉眼观察各主要脏器的病变情况，同时摘取小鼠的肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏，用生理盐水冲洗干净，吸去表面多余水分后立即精密称重，计算脏器系数，并将脏器放入4%中性多聚甲醛固定液中固定后切片、染色进行组织病理学观察。

1.7 统计学方法 使用SPSS 22.0 统计软件对数据进行处理分析，计量数据用（）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠一般状况比较 给药后两组小鼠均未出现死亡情况，空白组小鼠整体较为活泼好动，四肢灵活，皮肤、口、鼻等未发现异常分泌物，眼球无异样，呼吸正常，毛发干净、有光泽，饮水、进食、排尿及粪便正常。杠香组小鼠活动相对减少，喜静卧，1 h内全部恢复正常，皮肤、口、鼻等未发现异常分泌物，眼球、呼吸、毛发、饮水、进食、排尿及粪便与空白组比较基本无异样。第14 天解剖所有小鼠，与空白组比较，杠香组小鼠各脏器大小、形状、颜色、质地肉眼观察正常，没有发现坏死、肥大增生或萎缩等明显病理病变。

2.2 两组小鼠体重及总进食量比较 灌胃后14 d 内，两组小鼠体重总体呈增长趋势，杠香组雌、雄小鼠给药前后体重与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。观察期间，杠香组雌性小鼠给药前后总进食量低于空白组，而雄性小鼠给药前后总进食量高于空白组，其他无异常情况，见表2。

表1 两组小鼠体重比较（，g）

表1 两组小鼠体重比较（，g）

表2 两组小鼠总进食量比较（n，g）

2.3 两组小鼠各脏器系数比较 两组雌、雄小鼠主要脏器重量均在合理范围内；杠香组雌、雄小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏脏器系数分别与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 两组小鼠各脏器系数比较（）

表3 两组小鼠各脏器系数比较（）

2.4 杠香急性毒性实验对两组小鼠主要脏器病理形态的影响 ①空白组小鼠肝细胞形态结构完整、大小正常，细胞核大而圆，周围未发现炎症细胞浸润，肝细胞索以中央静脉为中心，呈放射状排列。与空白组比较，杠香组小鼠肝组织未发现明显异常；②空白组小鼠心肌细胞形态、大小、染色均正常，结构完整，未发现炎症细胞浸润，肌纤维排列有序，间隙未见异物。与空白组比较，杠香组小鼠心脏组织未发现明显异常；③空白组小鼠脾组织结构完整，白髓分散在红髓之中，白髓和脾小梁清晰可见，有明显的分界，淋巴小结、淋巴细胞等均未见异常。与空白组比较，杠香组小鼠脾脏组织未见明显损伤；④空白组小鼠肺组织充满许多大大小小呈空泡状的肺泡，多个肺泡共同开口形成肺泡囊，肺泡囊内部透明无异物，支气管结构完好，管径较大，管壁厚，无变性和坏死，未发现炎症细胞浸润。与空白组比较，杠香组小鼠肺组织未见明显损伤；⑤空白组小鼠肾脏组织可见肾小球和肾小管，肾小球形态完好、大小适中，囊腔无异常，周围未发现炎症细胞浸润，肾小管管壁完好，管腔内无异常。与空白组比较，杠香组小鼠肾脏组织无明显损伤。空白组与杠香组雌、雄小鼠各随机选取一张病理切片图，见图1。

3 讨论

急性毒性是指机体一次（或24 h 内多次）接触外来化合物之后所引起的中毒效应[10-12]。急性毒性试验是药物安全性评价的第一步[13，14]，常用方法有多种，如最大给药量法、最大耐受量法[5]、上下法[15]、固定剂量法[16]等，大部分中药、天然药物的急性毒性一般较低，可采用最大给药量法进行急性毒性研究[5，17]。

杠香作为西南少数民族地区习用香药，药用历史悠久。其在心血管、胃肠道疾病或跌打损伤、烧烫伤等方面的治疗效果良好，且资源丰富，可用于补充黄檀属药用植物资源，应用前景广阔。但目前有关其药理药效方面研究甚少，且缺乏相关的安全性研究报道。

本研究针对杠香的乙醇提取物进行了系统的小鼠急性毒性试验，主要通过以下几个指标评价其安全性：①体重和进食量的变化在一定程度上可以反映出动物的中毒情况。当药物对消化道具有刺激性时，消化道损伤可能造成动物拒食，饲料消耗量减少；若食物的消化和吸收受到影响，则会造成动物体重停止增长，甚至减轻；②心、肝、脾、肺、肾是重要的功能器官，经常会受到有毒物质损害，因此对其进行检查，可以发现潜在的器官靶向毒性[18]。本研究通过预实验确定无法采用半数致死量法进行，从而选用了适合杠香的最大给药量法，实验结果显示，杠香乙醇提取物折合生药材最大给药剂量42.4 g/kg 一次性灌胃给药后，小鼠在14 d 内未发现明显中毒反应，小鼠的体重和进食量均未产生明显变化，主要脏器没有明显损伤，脏器系数没有明显差异。参考2020 版药典中黄檀属代表药材降香日用剂量为9～15 g[19]，上述实验剂量大约相当于60 kg 成人日用剂量的170～280 倍[20-22]，在此剂量下未发现明显的急性毒性作用，说明杠香通过口服给药具有较高的安全性，实验结果与预期相符合。

综上所述，本研究为杠香的安全用药提供了一定的参考，但后续还需对杠香进行长期毒性实验，以更加全面地评价其安全性。此外，为进一步开发利用杠香，还需对其化学成分以及药理药效等方面进行深入研究。