长链非编码RNA-Hexokinase 2 的生物信息学分析

魏 晨，蒋 振

（川北医学院基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室，四川 南充 637000）

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）为长度超过200 个nt 的RNA 分子，尽管本身不编码蛋白，但其在多种疾病的发生发展过程中发挥着调控作用。大量研究表明[1-3]，lncRNA 与肿瘤的发生发展、侵袭转移、耐药及预后密切相关。己糖激酶（HKs）是一个普遍存在的磷酸化酶家族，可启动葡萄糖以供细胞内利用[4，5]。己糖激酶2 是该家族中最活跃的同工酶，主要在胰岛素敏感组织中表达。己糖激酶是一种进化上保守的磷酸化六碳糖（己糖）的酶。磷酸化的葡萄糖（葡萄糖-6-磷酸）在糖酵解中、糖原合成、磷酸戊糖和己糖胺生物合成途径，以及在ATP 合成、葡萄糖储存和蛋白质糖基化中以及肿瘤的发生发展中起关键作用[6，7]。在哺乳动物中，已经鉴定了4 种HK 同工酶（HK1～4），并且最近鉴定了命名为HKDC1（含有己糖激酶结构域的蛋白1）的第5 种同工酶。HK1 在大多数组织中普遍存在并构成主要的HK 形式；HK2 广泛存在，是胰岛素敏感器官如心脏、骨骼肌和脂肪组织以及广泛的肿瘤的主要同工酶。HK3 和HKDC1 表达有限，目前研究不多。HK4 具有在肝脏和胰腺β 细胞中高水平表达的单一催化部分，其分别控制糖原生成和胰岛素分泌。与HK4 相反，所有其它HKs 具有2 个酶的催化口袋，但只有HK2 中两种都起作用，而HK1、HK3 和HKDC1 仅在C-末端催化位点中具有活性[8，9]。上述研究表明，HK2 在多种器官的糖代谢及肿瘤的糖代谢中起着重要的作用，然而目前对于HK2 的研究多为针对单独的靶点进行细胞内的实验研究很少涉及对lncRNA-HK2 在细胞内功能的研究，这使得对lncRNA-HK2 的功能至今还不明确。为了全面阐明lncRNA-HK2 在细胞内的所调控的分子功能及生物学过程，本研究拟运用生物信息学分析方法，分析lncRNA-HK2 在细胞内的调控靶基因及信号通路，并对其进行生物学功能注释，阐述lncRNA-HK2 在细胞内的功能作用和分子机制。

1 资料与方法

1.1 lncRNA-HK2 靶基因预测 经NCBI 基因数据库查询lncRNA-HK2 的序列，经miRDB 数据库（http://www.mirdb.org/）和Starbase3.0 数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）预测与lncRNA-HK2 有miRNA-lncRNA 互作关系的miRNA，将miRDB 数据库预测到的miRNA 与Starbase3.0 数据库预测到的miRNA 取交集进行进一步分析。

1.2 miRNAs 靶基因预测 在Starbase3.0 数据库中分别对这些miRNA 进行靶基因预测，选取预测程序个数为3，预测靶基因评分比较高的前5 个，通过DAVI 数据库进行靶基因的GO 注释和信号通路富集分析。

1.3 GO 注释 从基因功能的3 个方面：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP）进行分析，得到具有统计学意义的GO 注释显著性分析（P＜0.05），信号通路富集分析阈值取P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-HK2 预测miRNAs 在miRDB 数据库预测到的miRNAs 有15 个与lncRNA-HK2 有miRNA-lncRNA 互作关系的miRNA，在Starbase3.0 数据库预测到有60 个，取两者交集共有2 个miRNAs，其miRNA 序列见表1。

表1 长链非编码RNA-HK2 预测的miRNAs

2.2 GO 注释分析 lncRNA-HK2 通过hsa-miR-374a-5p 作用的靶基因主要调控蛋白磷酸化、肿瘤发生通路、转录调控、DNA 损伤反应、脂肪细胞分化及胚胎发育等基因及信号通路；分子功能主要与细胞的酶结合、翻译抑制、泛素化结合、钙离子结合等有关；lncRNA-HK2 通过hsa-miR-374b-5p 作用的靶基因主要调控基因表达、调控序列特异性DNA 结合转录因子的活性、翻译调控、细胞对于胰岛素的反应等；分子功能主要与蛋白激酶活性、转录抑制活性、DNA 结合、染色质结合、金属离子结合及RNA聚合酶Ⅱ序列特异性DNA 转录因子结合等功能相关，见图1。

2.3 信号通路富集分析 lncRNA-HK2 通过hsamiR-374a-5p 作用的靶基因主要调控干细胞的多能干性、肿瘤中的信号通路、TGF-beta 信号通路、糖蛋白信号通路，以及肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌及胃癌等多种肿瘤发展的信号通路；lncRNA-HK2 通过hsa-miR-374a-5p 作用的靶基因主要调控人乳头状病毒感染、甲状旁腺激素合成、分泌及作用、MAPK 信号通路、TNF 信号通路、RAS 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药信号通路、生长激素合成、分泌及作用与ErbB 信号通路等细胞内参与多种功能的信号通路，见图2。

3 讨论

HK2 是己糖激酶家族中最活跃的同工酶，主要在胰岛素敏感组织中表达。大多数肿瘤细胞中的己糖激酶2 诱导有助于它们重新转向有氧糖酵解。HK2可以停靠在线粒体上，在自噬调节和细胞死亡抑制方面发挥功能，这些功能独立于其酶活性[10-13]。HK2水平和活性受许多转录、翻译和翻译后水平的因素调节。研究表明[14，15]，HK2 可以保护组织免受应激状态的影响，并有助于组织的正常发育。它是由生长因子如TGF-β 等诱导的，这些生长因子影响转录因子c-MYC 的激活，进一步调控HK2 基因表达。FGF 信号传导对血管形成很重要，内皮细胞和淋巴细胞中的HK2 降低可导致血液和淋巴血管缺陷，与FGF 受体（FGFR）-KO 小鼠相似。在成纤维细胞中，HK2 增强了TGF-β 的促纤维化作用，而HK2 基因敲除降低了TGF-β 刺激的纤维化过程[16-18]。这些结果说明，lncRNA-HK2 在细胞内也具有非常重要的功能。

本研究共得到2 个靶miRNAs，分别是miR-374a-5p 和miR-374b-5p。通过GO 功能注释和Pathway 信号通路富集发现，lncRNA-HK2 通过hsa-miR-374a-5p 作用的靶基因主要调控蛋白磷酸化、肿瘤发生通路、转录调控、DNA 损伤反应、脂肪细胞分化及胚胎发育等基因及信号通路，这些结果说明其生物学功能主要与细胞内蛋白功能调节、转录调控、DNA 损伤修复及肿瘤发生发展等多种功能密切相关。另一方面，lncRNA-HK2 通过hsa-miR-374b-5p 作用的靶基因主要调控基因表达、调控序列特异性DNA 结合转录因子的活性、翻译调控、细胞对于胰岛素的反应、细胞粘附及细胞周期等生物学过程，进一步说明其广泛参与调控细胞内的转录、翻译及细胞周期等基本生理过程。而它们的分子功能主要与蛋白激酶活性、转录抑制活性、DNA 结合、染色质结合、金属离子结合及RNA 聚合酶Ⅱ序列特异性DNA 转录因子结合等功能相关，说明其在细胞内与多种生物大分子结合并发挥作用。而lncRNAHK2 通过hsa-miR-374a-5p 作用的信号通路主要调控干细胞的多能干性、TGF-beta 信号通路、糖蛋白信号通路以及多种肿瘤发展的信号通路，表明其调控的功能主要与细胞生长，尤其是肿瘤性异常增生及其信号通路密切相关。此外通过hsa-miR-374a-5p 作用的信号通路主要调控甲状旁腺激素合成、分泌及作用，生长激素合成、分泌及作用，MAPK信号通路，TNF 信号通路，RAS 信号通路等细胞内参与多种功能的信号通路，提示它们的功能主要与细胞内肿瘤等多种疾病和生物合成信号通路相关。

综上所述，lncRNA-HK2 在细胞内调控的多个靶基因和信号通路，这些信号通路与多种疾病密切相关，lncRNA-HK2 可能作为有效的疾病诊断或治疗靶点。