山苍子精油对青贮玉米的霉菌抑制及品质影响研究

张福金， 张欣昕， 郭志刚， 刘广华， 李国银， 红格日其其格

（1.内蒙古自治区农牧业科学院 农业农村部农产品质量安全风险评估实验室，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古自治区农畜产品质量安全中心，内蒙古 呼和浩特 010010）

植物精油（EOs）是从植物花、叶、果实等部位提取的植物次生代谢产物（李桂珍等，2021）。目前开发利用的EOs种类约有300余种（汤友军等，2020；Tariq等，2019；Barbosa等，2016）。EOs主要从植物组织中提取，来源天然、无毒，具有较强的抑菌性和环境友好的优点，在抑制霉菌生长及毒素产生方面效果理想，目前主要应用于医疗、食品保鲜（姚依妮等，2021）、生态环境、畜牧等领域。EOs可抑制真菌生长和真菌毒素的产生。EOs对真菌细胞壁上形成膜电位，降低膜电位，破坏质子泵和消耗ATP有关，破坏ATP组装，导致细胞壁损伤（Turina等，2016）。同时，这种改变可能引起级联效应，使其他细胞器受到影响（Carson等，2002）。EOs破坏细胞结构的稳定，破坏细胞膜完整性，增加其通透性，从而导致细胞成分的泄漏和离子损失，影响细胞各种重要过程，如能量的产生、膜输送及代谢调节等（Tariq等，2019；Saad等，2013；Oussalah等，2006）。肉桂醛可以破坏质膜，进入细胞中的大分子物质空间结构内部，从而破坏物质的正常吸收、运输和代谢（Yin等，2020）。生姜、肉桂、马提尼挥发油可导致真菌细胞壁损伤，减小分生孢子形状和减少菌丝数量，降低伏马毒素的产生（Castro等，2020）。

青贮玉米、苜蓿等饲草在收获前、中、干燥和储存等环节中有可能受到黄曲霉等霉菌及霉菌毒素的污染，从而导致粮食、牧草的营养品质下降，对食用后的人和动物带来伤害。当前，控制饲草收储过程中产生的霉菌污染已成为促进畜牧业高质量发展的棘手问题。因此，选择对生物和环境没有伤害及污染，又能保证饲草营养品质的防霉剂是近几年研究的难点及热点。

山苍子（Litsea cubeba）是樟科木姜子属植物，是我国特有的香料植物资源之一（陈梓云等，2021）。山苍子的花、叶、果肉都可蒸提出山苍子油，其中果中的油含量最高，约占70%（李桂珍等，2021）。已有研究表明山苍子精油能抑制霉菌的生长（李欣越等，2021；蓝公毅，2020），以及与果蔬的保鲜（殷勇等，2021）等有关，但山苍子精油对某种特定霉菌的具体抑制能力研究还处于探索阶段，特别是精油在饲草控霉方面的应用研究还鲜见报道。因此本试验选择以山苍子精油作为防霉添加剂，研究其对青贮玉米特定霉菌的抑制作用，以及山苍子精油添加对青贮玉米营养品质的影响，为开发饲草天然植物防霉剂、减少饲草贮藏经济损失等提供应用数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 试验中所用山苍子精油购自江西恒诚天然香料有限公司，马铃薯-葡萄糖琼脂培养基购自北京环凯科技有限公司，其他药品聚乙二醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、吐温（分析纯）等购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备 试验中所用的仪器名称和型号见表1。

表1 试验所用仪器设备

1.3 试验方法

1.3.1 山苍子精油防霉剂的制备 以0.5 g聚乙二醇、10 mL无水乙醇、20 mL吐温80和60 mL蒸馏水为分散剂，加入10 mL山苍子精油，配制成山苍子精油含量为10%的防霉添加剂，使用时稀释。

1.3.2 霉菌分离纯化 采集300 g生长霉菌的青贮玉米样品，使用高速多功能摇摆粉碎机进行粉碎处理，称取适量的粉碎样品加至生理盐水中，用无菌均质器摇匀。获得样品溶液加到盛有生理盐水的试管里进行稀释。将已经稀释的溶液涂至PDA培养基上，在霉菌培养箱中28℃培养5 d。用接种环将不同颜色的纯霉菌菌落挑取，将其接种到新察氏琼脂平板上。培养5 d后对平板进行观察。若菌落中未生长出杂菌，则将纯菌种接种到新察氏培养基的斜面上，4℃甘油保存。

1.3.3 霉菌鉴定 利用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（B518259，生工生物），提取分离到的霉菌基因组，并通过引物扩增出基因中ITS序列，与NT数据库进行比对，获得相似序列的物种信息，借助Blast辅助判断物种信息。引物为ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

PCR反应体系（20 μL）：10×PCRBuffer 2.0 μL；引物F（10 μM）0.5 μL；引物R（10 μM）0.5 μL；dNTP（each 10 mM）2.0 μL；模板（DNA）2.0 μL；ddH2O 14 μL；Taq Plus DNA酶（5 U/μL）0.5 μL。

PCR反应程序：95℃5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，72℃10 min，30个循环。

1.3.4 山苍子精油最低抑菌浓度的测定 用镰刀菌、黄曲霉菌、杂色曲霉菌、青霉菌、根霉菌5株纯化菌分别制成浓度为106cfu/mL的菌悬液或孢子悬液后，分别取1 mL涂布于马铃薯-葡萄糖琼脂培养基上平板，在25℃下培养120 h，制作含菌平板。无菌条件下，取不同浓度山苍子精油处理直径1 cm滤纸片，置于新的马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，然后用直径8 mm打孔器移取含菌平板上的单个菌落至上述马铃薯-葡萄糖琼脂培养基上，同时吸取同体积无菌水代替山苍子精油作为空白对照。

1.3.5 山苍子精油的GC-MS分析 气相色谱条件：HP-5MS色谱柱；载气为高纯度氦气（99.999%），流速20 mL/min。升温程序：进样量1 μL，50℃保持1 min，以5℃/min升至260℃，保持5 min。质谱条件：电子轰击（EI）离子源，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，电子能量为70 e；扫描范围：50~600 amu。数据库：NIST Chemistry WebBook。

1.3.6 山苍子精油的抑霉效果及品质影响试验取青贮玉米原料，分别添加化学添加剂（0.15%丙酸）、山苍子精油（0.20%，制备方法见1.3.1），未加添加剂为对照组，原料与药剂混匀后分别装填于1 L青贮罐中，密封。青贮发酵45 d后开罐，自然状态放置2周有氧发酵后，测定不同处理霉菌数量、细菌和真菌多样性，生物重复3次。同时，测定其干物质、粗蛋白质、粗纤维、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、氨基酸、脂肪等营养成分。测定方法分别为：干物质，GB/T 6435-2014；粗蛋白质，凯氏定氮法；粗纤维，GB/T 6434；酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维，滤袋法；氨基酸，LC-MS/MS；脂肪GB/T 6433-2006。

2 结果与分析

2.1 霉菌鉴定 从青贮玉米中共分离到的霉菌提取基因组进行PCR扩增，同时获得的ITS序列在NCBI中进行BLAST对比，鉴定到9种霉菌（图1），分别为链格孢属、帚霉属、根霉属、青霉属、镰刀菌属、曲霉属、分支孢子菌属。本研究主要对分离鉴定较多的根霉、曲霉菌、杂曲霉、镰刀菌和青霉进行了进一步的研究（图2）。

图1 PCR产物电泳图

图2 从青贮玉米中分离到的霉菌

2.2 最小抑制浓度测定结果 将用不同浓度山苍子精油处理过的纸片放在培养基上，对培养基上的霉菌生长情况进行观察。曲霉抑制见图3，不同浓度的山苍子精油对霉菌的抑霉效应不同。同一种精油对不同霉菌的抑霉效果不同（表2）。山苍子精油对镰刀菌、黄曲霉、杂色曲霉、青霉、根霉的最小抑制浓度分别为0.14%、0.20%、0.20%、0.16%和0.12%，整体上，0.20%山苍子精油可抑制上述5种霉菌的生长。

表2 山苍子精油的最小抑制浓度

图3 不同浓度山苍子精油对曲霉菌的抑制作用

2.3 山苍子精油对不同霉菌的抑菌效果 将不同霉菌菌落分别涂布于含0.20%山苍子精油的马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，作为处理组，同时未添加山苍子精油的为对照组。由图4可知，对照组中均发生了霉菌生长，其中黄曲霉、杂色曲霉、青霉和根霉菌在培养基上已长满。而在含0.20%山苍子精油的处理组培养基上霉菌未生长，抑菌率达100%，抑制效果显著。

图4 0.20%山苍子精油对不同霉菌的抑霉效果

2.4 山苍子精油抗菌成分的GC-MS分析 对山苍子精油进行GC-MS定性定量分析显示（图5），从山苍子精油分离出来的化合物有15种（表3），其中含量百分比大于20%的主要成分有（Z）-柠檬醛（20.66%）、（E）-柠檬醛（21.67%）、肉桂醛（23.31%）、β-石竹烯（23.76%）、石竹素（29.23%）。由此可说明，山苍子精油抑霉主要成分是柠檬醛。精油对霉菌的抑制作用与其主要化学成分相关，相关抑制霉菌的机理还需进一步地研究。

表3 山苍子精油主要成分

图5 山苍子精油GC-MS总离子流谱图

2.5 不同添加剂对青贮玉米中霉菌的抑制效果在青贮玉米储存过程中加入添加剂可防止霉菌生长。在青贮玉米原料中加入化学添加剂（0.15%丙酸）、山苍子精油（0.20%），未加入任何添加剂的作为空白对照，45 d后，对霉菌数量进行统计分析（表4）。结果显示，青贮玉米中的霉菌数量由多到少分别是空白对照>0.15%丙酸处理>0.20%山苍子精油处理，加入0.15%丙酸和山苍子精油处理45 d对青贮玉米中霉菌的抑制率分别达到72.4%和98.0%。说明山苍子精油的抑霉效果远高于其他化学添加剂，可作为代替化学防霉剂的天然生物制剂使用。

表4 青贮玉米中添加不同防霉剂后的霉菌数量

2.6 山苍子精油对青贮玉米营养品质的影响霉菌影响青贮玉米的营养品质，为鉴定山苍子精油的影响程度，试验对比了添加0.15%丙酸和0.20%山苍子精油与空白对照之间的青贮玉米营养品质。结果如表5所示，青贮之前（0 d），玉米的粗蛋白质、粗纤维、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、脂肪酸和氨基酸的含量分别为7.78%、22.85%、48.73%、38.87%、1.55 g/100 g、95.86 mg/g，随着青贮时间延长，玉米的营养价值出现流失。加入山苍子精油防霉剂45 d后，青贮玉米的蛋白、脂肪酸和氨基酸含量显著高于对照组和0.15%丙酸组（P<0.05）。对照组（45 d）的蛋白、脂肪酸和氨基酸对比对照组（0 d）降低了3%、42%、17%，而加入0.20%山苍子精油后青贮玉米的粗蛋白质、脂肪酸和氨基酸的含量对比对照组（0 d）降低了1%、9%、8%，对比对照组（45 d）的粗蛋白质、脂肪酸、氨基酸减少了2%、31%、9%的损失；加入0.15%丙酸后粗蛋白质、脂肪酸和氨基酸对比对照组（0 d）降低了6%、45%、21%；说明添加山苍子精油能显著减缓青贮玉米蛋白、脂肪酸和氨基酸的损失，并且其效果高于加入化学添加剂。

表5 山苍子精油防霉剂对青贮玉米营养品质的作用

3 讨论

3.1 山苍子精油的抑霉效果 植物精油能抑制霉菌生长，可通过改变细胞通透性、抑制生物膜合成、减少可溶性蛋白质含量、改变细菌形态结构来影响霉菌的新陈代谢，从而起到抑菌、杀菌作用（Cabral等，2013）。山苍子精油具有用作生物杀菌剂的潜力，并且可能取代合成杀菌剂。山苍子精油具有抑制轮枝镰刀菌的菌丝生长发育、FB1和FB2合成以及改变形态结构的作用（Pante等，2021）。Li等（2016）研究发现，山苍子精油可以有效抑制甘草中黄曲霉AFB1的积累（Li等，2016）。

在本试验中，与对照组相比，在含0.20%山苍子精油的培养基上霉菌未生长，抑菌率达100%，抑制效果显著。对山苍子精油分离到抑霉主要成分为柠檬醛，与Wang等（2018）研究山苍子精油成分分析结果一致，Wang等（2018）从山苍子精油中分离到18个挥发性化合物，包括α-蒎烯、β-水芹烯、β-蒎烯、柠檬醛、香茅醛等，其中柠檬醛的主要活性成分为α-柠檬醛和β-柠檬醛，相对含量最高。同时，加入化学添加剂和山苍子精油后对青贮玉米中霉菌的抑制率分别达到72.4%和98.0%，说明山苍子精油的抑霉效果远高于其他化学添加剂，可代替化学防霉剂。这与陈梓云等（2021）对山苍子精油对玉米粉、小麦粉的抑霉以及殷勇等（2021）研究山苍子精油对辣椒贮藏期间抑霉效果一致。

3.2 山苍子精油对青贮玉米营养品质的影响精油被美国食品和药物管理局 （FDA）视为“GRAS”（一般认为是安全的）级化学品，可应用于食品行业中。山苍子精油来源广泛，价格低廉，具有副作用小、不易产生耐药性的优势。根据GB2760-86标准，我国已批准山苍子精油用于食品、医药、化工等行业中（方学军，2007）。因此，以山苍子精油为原料，将其制成食品保鲜剂或药食同源产品有良好前景。此外，山苍子精油的抗氧化活性也可以防止农产品腐烂（Pante等，2021）。

青贮玉米饲料的营养价值较高，其贮藏期长等优势成为世界公认的草食牲畜不可或缺的优质饲料（王安贵等，2021）。徐生阳等（2021、2020）研究不同添加剂对青贮羊草的营养品质的影响发现，加入孜然精油有利于保存牧草蛋白质，并能提高体外消化率（IVDMD），提高牧草饲料的营养价值。在本试验中，添加山苍子精油能减缓青贮玉米中粗蛋白质、脂肪酸和氨基酸的损失，而粗纤维、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维的差别不明显，相比化学添加剂其效果更好。这说明添加山苍子精油可保持青贮玉米品质，其植物提取物属性更符合绿色生物防霉剂的选择目标。目前，有关山苍子精油对饲草在储存过程中对营养品质的影响相关研究很少，生物添加剂的筛选为饲草产品高质量发展提供了新的选择方向。

4 结论

从抑菌作用来看，0.20%山苍子精油可抑制镰刀菌、黄曲霉、杂色曲霉、青霉、根霉，其主要抑菌成分为柠檬醛。从品质调控来看，在青贮玉米中加入0.20%山苍子精油可减缓粗蛋白质、脂肪酸和氨基酸的损失，效果优于化学添加剂。