山羊溶血性曼氏杆菌与多杀性巴氏杆菌混合感染诊治

高山雁，胡 园，罗 勤，杨世忠，杨发龙

（1.四川省会东县农业农村局，四川 会东 615200；2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041；3.四川省珙县农业农村局，四川 珙县 644500；4.四川省凉山州畜牧兽医科学研究所，四川 西昌 615000）

1 发病情况

某山羊养殖场存栏黑山羊500 只左右，羊以放牧为主，补饲为辅。因放牧时天气乍雨乍晴，陆续有周岁以下的山羊出现精神萎靡，眼角有脓性分泌物，咳嗽，流清亮鼻液的临床症状。羊发病早期用替米考星治疗，效果较好，但病情随后出现反复，后期治疗效果较差。

2 实验室诊断

2.1 病原PCR检测 无菌采集病山羊的鼻腔拭子送检，用酚-氯仿法提取样本总DNA，用于绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、丝状支原体以及溶血性曼氏杆菌等常见的引起山羊呼吸道疾病病原的PCR 检测。本次PCR 扩增鉴定引物参照文献，引物信息见表1。

表1 各引物信息

病原的PCR 扩增鉴定采用25 μL 反应体系，即Premix Taq 酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，去离子水8.5 μL。PCR 反应条件为：95 ℃5 min；94 ℃30 s，54～60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃10 min 终止反应。PCR反应结束后，采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，于凝胶成像系统观察结果。结果显示溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌扩增条带与目的条带大小一致，分别为207 bp和460 bp，其余扩增结果均为阴性。

2.2 细菌分离鉴定

2.2.1 细菌分离培养 无菌采集40 只病山羊的鼻腔拭子，划线接种于20 个绵羊血琼脂平板上，将血平板置于37 ℃恒温培养箱培养18 h。结果平板上长出大小不一且有溶血环的光滑、湿润、露珠样的菌落，从每个平板上挑取疑似的单个菌落接种到含5%新生牛血清的TSA 固体培养基上进行纯化，对纯化后的单个菌落进行染色、镜检，结果见革兰氏阴性短杆菌。无菌挑取单个菌落接于新的TSB液体培养基中，置于37 ℃的空气浴水平摇床（160 r/min）进行增菌，培养8 h。

2.2.2 菌落PCR 鉴定 取增菌菌液，用酚-氯仿法提取细菌总DNA，以溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌特异性引物进行PCR扩增，结果显示扩增片段长度与预期片段长度相符。将鉴定后的菌液外送测序，采用DNAStar 软件对测序结果进行序列分析，通过网络数据库NCBI进行比对，结果显示所获得的序列与NCBI 已公布的溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌序列的相似性为100%，表明所分离到的菌株为溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌。

3 诊断

综合流行病学、临床症状以及实验室检查结果，确诊山羊的呼吸道疾病是由溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌混合感染引起的。

4 防治

4.1 疫苗免疫

4.1.1 疫苗制备 复苏细菌：蘸取甘油保种菌液（纯化得到的菌株）进行平板划线，培养18 h；增菌：将培养基上的单个菌落扩增到含2 mL培养液的无菌离心管中；扩大培养：根据所需菌液量扩大培养细菌；甲醛灭活：按菌液容量加入0.2%的甲醛，灭活8 h。取100 μL增菌液进行平板涂布，观察是否灭活完全；乳化：量取等量的菌液与佐剂加入匀浆机中，匀浆15 min，然后倒入烧杯中，采用小风扇继续乳化30 min至乳白色，乳化完成后，制备液装入无菌容器内常温放置过夜，疫苗即制作完成。

4.1.2 疫苗接种 经无菌检验后的疫苗低温冷藏保存并运至接种场，先接种4～5 只山羊，其无异常反应后，再开展全群免疫，每只羊于颈部皮下注射3～5 mL。

4.2 药物治疗

4.2.1 药敏试验 采用纸片扩散法对分离纯化的溶血性曼氏杆菌菌株和多杀性巴氏杆菌菌株进行药敏试验。试验结果判定按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）指导标准，以“敏感、中介、耐药”记录结果，其结果见表2、表3。

表2 分离溶血性曼氏杆菌菌株药敏试验结果

表3 分离多杀性巴氏杆菌菌株药敏试验结果

4.2.2 药物治疗 根据药敏试验结果，选用氟苯尼考对病羊进行治疗（剂量和用法遵照说明书使用），同时加强羊的营养，注意通风和消毒。

5 小结

溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌是革兰氏阴性菌，是山羊、绵羊、牛等反刍动物呼吸道的常在菌，当遇环境骤变、运输不当等不良因素时，可引起发病。PCR 检测技术具有快速、灵敏、准确的优点，能够对这两种病菌感染作出确定诊断。

规模化集约化养殖中，除关注羊群的疾病防控外，还要注意加强饲养管理，特别在环境突然改变的情况下，要尽量避免羊只因抵抗力减弱而发病。