陈化六堡茶的主要品质化学成分及其抗氧化活性分析

杨高中，马士成，张 悦，林 智，吕海鹏

（1.农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室/中国农业科学院 茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.梧州市六堡茶研究会，广西梧州 543000）

六堡茶是选用广西壮族自治区苍梧县群体种、广西大中叶种及其分离、选育的品种、品系茶树的鲜叶为原料，按特定的工艺加工而成的，是我国代表性黑茶产品之一，具有独特的风味品质和保健功效[1-2]。研究表明，六堡茶与茯砖茶[3]、普洱茶[4]等其他黑茶类似，具有调节糖脂代谢、肠道菌群等保健功效，倍受越来越多消费者的关注和喜爱。ZHU等[5]采用六堡茶提取物干预治疗高血糖小鼠模型，发现六堡茶提取物能够通过增加肠道菌群的多样性（增加有益细菌的丰度，并减少有害细菌的丰度），从而缓解高血糖引起的代谢紊乱。吴文亮等[6]研究发现，陈年六堡茶能有效抑制高脂血症小鼠的体质量、肝质量等指标增加，显著缓解肝脏中脂肪堆积。长期以来，陈化工艺对黑茶风味品质和生物活性的影响已经成为了黑茶研究中的重要热点问题。CHENG等[7]采用液相色谱串联质谱方法对不同贮藏年份青砖茶的特征代谢成分进行检测，研究发现，长达10 a的储藏时间有利于改善青砖茶的苦涩味，这主要与黄酮类成分的甲基化、糖基化修饰以及氧化降解有关。经过一定时间的贮存陈化，六堡茶中的生化成分在湿热及微生物的作用下发生一些变化，其品质可得到较大提高[8]。然而，目前对不同陈化年份六堡茶的抗氧化活性及其主要品质化学成分鲜有报道。

食品的抗氧化活性评价通常采用化学分析法和生物学分析法两类，前者主要包括清除1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基活性、铁离子还原（Ferric reducing antioxidant power，FRAP）法、清除2，2-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）自由基活性以及清除超氧阴离子自由基活性等；后者例如细胞抗氧化法（Cellular antioxidant activity，CAA）则更具生物相关性[9]。有研究指出，在抗氧化分析中，宜选用多种方法同时进行分析检测，从而对其进行更全面的抗氧化活性评价[10]。

本研究选用不同陈化时间的六堡茶样品为研究对象，首先检测分析茶汤中的主要化学成分的含量水平等，其次分别采用化学分析法和生物学方法等评价它们的抗氧化活性，最后再进行相关性分析，旨在为揭示不同陈化时间对六堡茶产品主要品质化学成分和抗氧化活性的影响提供参考依据，丰富六堡茶陈化的基础理论。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料15个具有代表性的六堡茶样品（编号为LPT1～LPT15），主要由梧州市六堡茶研究会提供，少量样品采集自市场。根据样品的不同陈化时间进行分类，将该批次样品分为3组，即陈化6 a的样品、陈化8 a左右的样品以及陈化10 a以上的样品。

1.1.2 主要试剂表没食子酸儿茶素（EGC）、儿茶素（C）、表没食子酸没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、2，2'-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS），购于Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；没食子酸（GA）标准品，购于上海百灵威化学技术有限公司；甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑蓝、核黄素，购于国药集团；Hank's平衡盐溶液、DMEM培养基，购于美国Gibco公司；胎牛血清，购于杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素-链霉素溶液，购于碧云天生物技术研究所；2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）、人肝癌细胞系HepG2，购于北京嘉美生物技术有限公司；乙腈（色谱纯），购于德国Merck公司；冰乙酸、甲酸、硫酸亚铁、三氯化铁、过硫酸钾、醋酸钠均为分析纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；去离子水，采用Milli-Q水净化系统（美国Millipore公司）制备。

1.2 仪器与设备

UV-2550紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司），1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Varioskan Flash酶 标 仪、Hepa Class 100二 氧 化 碳培养箱（美国Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 陈化六堡茶样品的感官审评及水浸出物含量分析委托农业农村部茶叶质量监督检验测试中心对样品进行感官审评（GB/T 23776—2018）；茶叶水浸出物含量测定参照GB/T 8305—2013进行。

1.3.2 茶汤制备称取3.0 g茶样于三角瓶中，加入150 mL的100℃去离子水浸提5 min，脱脂棉过滤；冷却后过0.45 μm水膜，贮藏于4℃冰箱待测。

1.3.3 陈化六堡茶样品的主要化学成分测定茶多酚采用酒石酸亚铁法测定（参照GB/T 8313—2002）；儿茶素采用高效液相色谱方法测定；茶褐素采用系统比色法测定；黄酮总量采用三氯化铝比色法测定；游离氨基酸总量采用茚三酮比色法测定（GB/T 8314—2013）。

1.3.4 陈化六堡茶样品的抗氧化活性分析

1.3.4.1 铁离子还原法（FRAP法）测定总抗氧化活性参照文献[11]的方法，采用铁离子还原法测定总抗氧化活性。以1.0 mmol/L FeSO4为标准，样品的总抗氧化能力（FRAP值）采用达到相同吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示，单位为μmol/L。

1.3.4.2 清除DPPH自由基活性测定参照文献[12]进行测定。式中，A对照为对照组的吸光度；A样品为样品组的吸光度。

1.3.4.3 清除ABTS自由基活性测定 参照文献[13]进行测定。

1.3.4.4 超氧阴离子自由基活性测定参照文献[14]进行。

式中，A0为样品避光反应30 min后的吸光度；A1为样品反应30 min后的吸光度；A2为采用去离子水取代样品反应30 min后的吸光度。

1.3.4.5 细胞抗氧化能力测定参照文献[9]进行。茶汤的细胞抗氧化能力（CAA值）以每100 mg干物质等同于槲皮素的微摩尔当量表示，单位为

μmol/100 mg。

1.4 数据分析

试验所有数据的差异显著性分析采用SPSS 17.0软件进行，采用GraphPad prism 9进行绘图。

2 结果与分析

2.1 陈化六堡茶样品的感官审评结果及其水浸出物含量分析

陈化六堡茶样品感官审评结果及其水浸出物含量分析如表1所示。

从表1可以看出，该批次样品中，水浸出物含量在33.5%以上的样品（LPT-3、LPT-6、LPT-7、LPT-8、LPT-14、LPT-15），均表现出外形紧，汤色红亮或橙黄明亮，滋味和、醇，叶底软、褐的品质特点；水浸出物含量在30.0%～33.5%的样品（LPT-1、LPT-2、LPT-4、LPT-5），存在外形棕褐、梗多，汤色较亮，滋味醇，叶底暗褐的品质特点；水浸出物含量在28.0%～30.0%的样品（LPT-9、LPT-10、LPT-11），存在外形欠紧实、叶底硬、暗褐的特点。此外，由于LPT-12和LPT-13这2个样品水浸出物含量较低，低于《地理标志产品 六堡茶》（DB45/T 1114—2014）中所规定的最低要求，故在本研究的后续分析中剔除了这2个样品。

2.2 陈化六堡茶样品中主要化学成分的含量水平分析

13个陈化六堡茶样品茶汤中的水浸出物、茶多酚、游离氨基酸总量、黄酮总量、儿茶素总量、儿茶素组分、没食子酸以及茶褐素的检测分析结果如表2所示。水浸出物高低反映了茶叶中可溶性物质的多少，本研究中水浸出物含量介于1.502～3.846 mg/mL，其中，六堡茶样品LPT-6、LPT-7的水浸出物含量具有较高水平，分别达到了3.846、3.048 mg/mL。本研究中茶多酚含量存在较大差异，总体上介于0.225～1.755 mg/mL，其中含量最大值为LPT-6样品（1.755 mg/mL）。茶叶中的游离氨基酸对茶叶的品质具有重要作用，本研究中游离氨基酸总量介于0.056～0.142 mg/mL，其中，LPT-6样品具有最高含量（0.142 mg/mL）。13个陈化六堡茶样品茶汤中黄酮总量差异不大，总体上介于0.066～0.138 mg/mL；而儿茶素总量的差异较大，介于0.015～0.581 mg/mL。茶叶中的儿茶素成分，除LPT-6样品的EGC和EGCG含量较高外，其他样品的茶汤中在儿茶素各组分的含量上均差异不大。本研究中酚酸的代表性物质没食子酸含量介于0.003～0.098 mg/mL，其中，LPT-7样品没食子酸含量最高（0.098 mg/mL），而LPT-14样品的没食子酸含量最低，仅0.003 mg/mL。此外，茶褐素是六堡茶中重要的品质化学成分[15]，本研究中其含量水平介于0.312～0.845 mg/mL。总体而言，随着陈化时间的增加，六堡茶茶汤中水浸出总量、茶多酚、儿茶素总量以及游离氨基酸等主要化学成分含量呈下降趋势，而茶褐素含量呈增加趋势。需要指出的是，本研究中茶汤的提取方式主要参考常规饮茶的情况开展的，鉴于茶叶没有粉碎且提取时间较短等因素，检测结果中主要化学成分的含量水平要明显低于茶叶常规理化检测中的含量水平。

表2 陈化六堡茶茶汤中的主要化学成分的含量比较Tab.2 Comparison of the content of main chemical components in tea infusion of aged Liupao tea mg/mL

2.3 不同陈化时间六堡茶的抗氧化活性分析

从图1可以看出，随着陈化时间的延长，六堡茶的FRAP值存在降低的趋势。陈化6 a的六堡茶样品的FRAP值介于1.48～3.23 μmol/L，平均值为2.62 μmol/L；统计分析表明，其FRAP值显著高于另外2组六堡茶样品（P＜0.05）。陈化8 a左右的六堡茶样品的FRAP值介于1.69～1.83 μmol/L，平均值为1.74 μmol/L；而陈化10 a以上的六堡茶样品的FRAP值 介 于1.00～1.58 μmol/L，平 均 值 为1.27 μmol/L；统计分析表明，这2组样品的FRAP值不存在显著差异（P＞0.05）。此外，不同陈化时间六堡茶样品的清除DPPH、ABTS以及超氧阴离子自由基活性均表现出了类似的规律，即一般随着陈化时间增加而活性降低。其中，陈化6 a的六堡茶样品对3种自由基的清除率均为最高，平均值分别为78.39%、56.48%、84.07%，表明其抗氧化活性最强。而陈化10 a以上的六堡茶样品的3种自由基清除率均为最低，平均值分别为61.02%、30.91%、68.64%，且均显著低于陈化6 a的样品（P＜0.05）。

图1 不同陈化时间六堡茶的抗氧化活性分析Fig.1 Antioxidant activities of Liupao tea with different aging time

CAA值以槲皮素的微摩尔当量表示，反映了该物质的细胞抗氧化活性强弱，该数值越大则表明其细胞抗氧化活性越强。不同年份六堡茶的细胞抗氧化活性分析结果如图2所示。

从图2可以看出，陈化6 a以及8 a左右、10 a以上的六堡茶样品的槲皮素当量平均值分别为2.18、2.62、3.21 μmol/100 mg。统计分析表明，本研究中陈化6 a的六堡茶样品的CAA活性显著低于陈化10 a以上的六堡茶样品的CAA活性（P＜0.05），可见，随着陈化时间的延长，六堡茶的CAA活性具有一定的增加趋势。

图2 不同陈化时间六堡茶的CAA抗氧化活性分析Fig.2 CAA activities of Liupao tea with different aging time

2.4 相关性分析

相关性分析表明（表3），采用化学分析法检测的六堡茶的抗氧化活性与其水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、EGC、EC等化学成分的含量水平存在较强的相关性。由表3可知，茶多酚含量与六堡茶的FRAP值、DPPH自由基清除率以及超氧阴离子自由基清除率的相关性系数分别达到了0.757、0.740、0.745，且均达到极显著相关水平（P＜0.01）。此 外，EC与FRAP值、DPPH自由 基 清除 率 以及ABTS自由基清除率在0.01水平上表现出极显著相关，而与超氧阴离子自由基清除率在0.05水平上表现显著相关；其他儿茶素成分C、EGCG以及ECG等与其抗氧化活性均不存在相关性关系。本研究中，没食子酸的含量与抗氧化活性检测中FRAP值在0.05水平上表现出显著相关，相关系数为0.637。值得注意的是，茶褐素作为六堡茶中重要的品质化学成分，在本研究中发现该成分与六堡茶4种化学分析法检测的抗氧化活性之间呈现负相关，这与ZHOU等[16]的研究结果基本趋于一致。陈化六堡茶的细胞抗氧化能力与本研究中主要品质化学成分的含量水平不存在较强的相关性；其CAA活性与茶褐素的含量呈现一定的正相关性，但未达到显著性水平。

表3 六堡茶主要化学成分含量与其抗氧化活性的相关性分析Tab.3 Correlation analysis of the content of the main chemical components of Liupao tea and their antioxidant activity

3 结论与讨论

近年来，关于六堡茶的化学成分研究逐渐增多，科研工作者已经从六堡茶中分离鉴定出一些新的酚性化合物成分以及棕榈酸、没食子酸甲酯、α-菠甾醇等[1，17]。研究表明，六堡茶随着陈化时间的延长，咖啡碱和茶褐素的含量呈上升趋势，而水浸出物含量、游离氨基酸总量、茶多酚含量呈减少趋势，与本研究的结果基本趋于一致[8]。随着陈化时间的增加，六堡茶中的单体儿茶素可能进一步通过微生物分解的胞外酶氧化聚合成茶色素（如茶黄素、茶红素和茶褐素）或降解为酚酸（例如没食子酸、原儿茶酸和咖啡酸），而游离氨基酸组分则被作为氮源被代谢消耗[18]。总体上，陈化条件的差异可能是影响六堡茶感官品质和理化成分变化快慢的重要因素之一。

综合分析本研究中不同陈化时间六堡茶的抗氧化活性差异，可见随着陈化时间的延长，采用化学分析法检测的六堡茶的抗氧化活性（FRAP值、DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率）都存在降低的趋势，这与普洱茶的研究结果类似[19]。在本研究中，一般是陈化6 a样品的抗氧化活性最强，陈化8 a左右的样品次之，而陈化10 a以上的样品最弱；总体上，3组样品相比，陈化6 a的样品与陈化10 a以上的样品一般都存在显著性差异（P＜0.05）。茶多酚类化合物是茶叶中重要的抗氧化活性成分，随着陈化时间的增加，茶多酚含量呈现出下降趋势，可能是导致不同陈化年份六堡茶的抗氧化活性差异的重要因素。另外，相较于上述4种化学抗氧化活性分析法，细胞抗氧化活性的生物相关性更强，能更好地预测体内的抗氧化活性。采用生物学方法检测六堡茶的细胞抗氧化能力发现，随着陈化时间的延长，其细胞抗氧化活性具有一定的增加趋势。以往有研究表明，黑茶茶色素提取物具有细胞抗氧化活性，其作用机理可能是通过提高清除细胞活性氧的酶活力和促进合成还原性物质来实现的[20]。此外，在六堡茶的陈化过程中，可能产生了一些新的活性成分从而增强了其细胞抗氧化活性，还有待后续进一步开展研究。受试验样品等诸多限制，本研究中未能设置当年的六堡茶样品以及陈化3 a左右的样品进行检测（未能取得一定数量的代表性样品），因此，不能分析陈化初期阶段六堡茶主要化学成分及其抗氧化活性的变化规律情况。同时，本研究中所分析的六堡茶样品也可能受到茶树品种、采摘季节、制作工艺、存贮方法等多种不同因素的影响。因此，在后续研究中，宜选用相同鲜叶原料制作的一批六堡茶样品，在趋于相同的储存环境下，逐年度取样分析样品的抗氧化活性变化情况，这对于揭示六堡茶的抗氧化活性变化规律及其陈化机制等具有重要意义。

多酚类化合物，如儿茶素（尤其是EGCG），是绿茶、乌龙茶以及白茶等发挥体外抗氧化活性的重要化学成分[21]。作为一种微生物发酵茶，六堡茶中的重要抗氧化成分尚需进一步研究。本研究中陈化六堡茶的茶多酚总量、EGC、EC等化学成分与化学抗氧化方法存在显著相关性。ZHOU等[16]研究表明，普洱茶中的茶多酚、儿茶素和2种黄酮（芦丁和山柰酚）的多酚成分与其体外抗氧化活性（如FRAP值、DPPH自 由 基清除率 以 及ABTS自 由 基清除率）具有一定的相关性，这与本研究结果基本趋于一致。

本研究结果表明，6 a以及8 a左右和10 a以上等不同陈化时间的六堡茶中主要品质化学成分的含量水平存在较大的差异，其中水浸出物含量、茶多酚、游离氨基酸总量、黄酮总量、儿茶素总量、ECG、EC、EGCG、EGC、C、没食子酸等化学成分一般随着陈化时间的增加有降低的趋势，而茶褐素有增加的趋势。不同陈化时间对六堡茶的抗氧化活性也具有重要影响，六堡茶的清除DPPH自由基活性、清除ABTS自由基活性以及清除超氧阴离子自由基活性等一般随着陈化时间的增加呈降低的趋势，而细胞抗氧化能力有增加趋势。陈化六堡茶的抗氧化活性一般与水浸出物总量、茶多酚总量、EGC、EC等化学成分的含量水平存在较强的相关性，六堡茶陈化过程中化学成分的转化规律后续需要开展进一步研究。