益生菌安全性与功能性评价方法研究进展

张国华，田慧颖，何国庆

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）

益生菌的英文是Probiotics，最早来源于希腊语的pro bios，意思是For life，即终生、益生的意思[1]。Probiotics在1953年首次被提出，它是一种包含了抗生素和抑菌物质的有益食品的结合体[2]。1965年，LILLY等[3]研究认为，Probiotics是由微生物产生的生长促进因子。罗伊·富勒于1989年第1次在益生菌的概念中引进了微生物的活性和有益作用[4]。2001年，联合国粮农组织（FAO）/世界卫生组织（WHO）共同提出了益生菌的科学定义：益生菌是指在摄入足够多的情况下，对人体健康有益的微生物。2014年，国际益生菌与益生元联盟发表共识，就益生菌的概念提出了三大基本特性，即足够数量、活菌状态、有益健康功能[5]。

目前，益生菌主要有以下几类：（1）乳酸菌，包括乳杆菌、双歧杆菌、链球菌；（2）不产乳酸型细菌，包括芽胞杆菌、丙酸菌；（3）非病原性酵母，包括酵母菌；（4）无芽胞和无鞭毛的一类杆菌或球杆菌[6]。

日本科学家代田稔于1930年从人体肠道中分离出一种能够耐胃酸的乳酸杆菌，将其命名为干酪乳杆菌代田株（Lactobacillus caseistrain shirota）。之后，日本生产的乳酸菌饮品养乐多标志着益生菌进入了工业化生产阶段[7]。随着益生菌在乳制品、休闲食品、发酵果蔬制品等产品上广泛的应用，它的安全问题以及健康功效是否可靠变成了消费者关注的重点。人们一般认为，乳杆菌与双歧杆菌这2个一直用于保健品的益生菌是安全的，但随着科学发展，研究人员发现原则上一切微生物都能成为人体中潜在的致病菌。Philippe研究认为，益生菌对人体的危害主要有进入血液引起全身感染、产生有毒代谢物、食用后产生免疫刺激以及耐药基因的转移[8]。但目前国内对益生菌的安全性和功能性评价的研究仍处于落后状态。

近年来大量研究显示，益生菌对人体的健康发挥了巨大作用。益生菌可以调节人体肠道正常菌群、维持体内微生态平衡、促进食物消化和润肠通便等。文章将主要介绍目前我国益生菌的安全性及功能性评价的方法，以期对未来益生菌的发展提供帮助。

1 对益生菌进行安全性与功能性评价的必要

首先，益生菌的定义就要求了益生菌的安全性与功效性。2020年，中国食品科学技术学会益生菌分会发布了《益生菌的科学共识（2020年版）》，指出益生菌3个核心特征为足够数量、活菌状态和有益健康功能[9]。在国家市场监督管理总局公开的《益生菌类保健食品申报与审评规定（征求意见稿）》中第二条也明确指出：益生菌系指活的微生物，当摄取足够数量时，对宿主健康有益[10]。益生菌的保健食品是一种以益生菌为主要功能成分的微生物产品，当摄入足够数量时，可以对人体健康起有益作用。益生菌类的保健食品必须保证食用安全，不得对人体产生任何急性、亚急性或者慢性的危害[11]。

其次，一些益生菌的安全性与功效性都不尽相同。《益生菌类保健食品申报与审评规定（征求意见稿）》中第三条指出：生产益生菌类保健食品所用菌种（株）的生物学、遗传学、功效学特性应明确和稳定，菌种（株）及其代谢产物必须无毒无害。国家卫生行政部门发布的可用于食品的菌种（株）可用于益生菌类保健食品，菌种（株）除符合安全性的要求外，还应具有充足的研究数据和科学共识支持其具有保健功能[10]。

因此，对益生菌的安全性与功能性进行评价很有必要，否则会极大地限制益生菌产业的发展，甚至可能产生一定的安全风险。

2 益生菌安全性评价方法

《食品用益生菌安全性评价指导原则》对益生菌的评价，主要包括4个方面：（1）菌种鉴定到株；（2）功能评价；（3）安全性评价；（4）对益生菌产品标签信息的规范要求[12]。

FAO/WHO认为，益生菌的安全评估应从评估其对抗生素的耐药性开始。同时也要对它的代谢产物进行评估，评估人体试验产生的不良副作用；以及在市场上出售后，有必要对发生的不良反应进行流行病学调查。若所用的益生菌菌株所属的菌种具有溶血活性，那么被评估的菌株就需要进行溶血试验。另外，FAO/WHO专家小组强烈建议，应评估益生菌菌株对免疫功能低下的模型动物是否具有感染性[12]。

目前，我国对益生菌菌种（株）安全评价主要围绕菌种鉴定、动物致病性试验、产毒试验、耐药性试验4个方面。

2.1 菌种鉴定

通过分类鉴定，确定益生菌的菌种，是评价其安全性的重要依据，也是评价其安全性的首要步骤。通过对评价菌株的菌属特征的了解，研究人员可以对其进行初步判断和预测。

对于菌种鉴定，各国和组织都有相应的法律法规。如欧洲食品安全局制定的“安全合理假设”（QPS）中，将精确识别益生菌作为评价微生物安全性的依据和先决条件[13]。FAO/WHO则认为，菌株应先进行表型试验，然后采用DNA/DNA杂交、16S RNA序列测定以及其他可靠的方法进行遗传学鉴别，并采用DNA脉冲场梯度凝胶电泳法（PFGE）对该菌株进行鉴别，经过多种方法结合，菌种鉴定的可靠性和精确性会大幅提高[14]。

我国标准中关于双歧杆菌检验（GB 4789.34—2016）、乳酸菌检验（GB 4789.35—2016）的菌种鉴定，主要以生理生化鉴定作为菌种鉴定依据，新的指导原则里也提出要采用分子生物手段进行菌种鉴定到菌株水平。目前，全基因组测序已成为国际上菌种鉴定的金标准。通过全基因组测序，可以提供菌株是否含有致病基因、环境抗性基因、耐药基因、产毒基因等信息。在我国《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则（2020年版）》中，菌种鉴定除了常规生理生化特性试验，还增加了全基因组测序。用于保健食品的益生菌菌株需要提供基于表型及基因测序技术鉴定到种水平的资料，同时作为保健食品的功效成分（活菌），还应提供鉴定到株水平的资料[15]。

2.2 动物致病性试验

为了科学和管理，益生菌菌株在广泛投入生产之前需要评估其安全性，一般是进行体内试验。通过体内模型，可以评估益生菌的毒性以及可能对宿主造成严重的疾病和免疫缺陷。研究人员通过建立不同的动物模型，可以更好地研究益生菌的作用机制，及其对人体健康和安全方面的影响。在研究益生菌的过程中，经常采用有脊椎的动物进行体内试验，最常用的是小鼠和大鼠。在兽医界，其他动物和鱼类也被用来进行益生菌的体内研究[16]。

致病性（pathogenicity）是指被试细菌对宿主的致病能力，由其种属特征决定。不同细菌的致病性存在着一定的差别，这与细菌自身的侵袭力和它们的代谢产物有关。自2000年起，全国食品安全风险评价中心共检测了200多株益生菌，经灌胃试验发现，它们并无致病性，经对小鼠进行腹腔注射试验发现，当菌数达到1.0×109cfu/mL时，个别菌株可致病。这也表明，当前市场上的益生菌菌株都是安全的。

参照美国的有关规定，在动物致病性试验中，既要进行灌胃，还要进行腹腔注射，观察期为21 d，灌胃量是腹腔注射量的10倍。我国的《保健食品用菌种致病性评价程序（征求意见稿，2020）》也提出了相似的评价方法[17]。

2.3 产毒试验

对于一些可能会产生毒性的微生物，必须在不同的环境中（单品种固体、多品种固体复合、不同成分的液体组合）进行产毒试验，并根据国家标准检测方法或国际组织/相关国家规定的标准检测方法进行代谢产物含量的测定[18]。从我国批准的可用作保健食品的菌种清单来看，红曲霉属应进行桔青霉素产毒试验[17]。

可作为保健食品生产用的菌种，试验结果需要出现以下结果1个以上：第一，3个以上国家批准作为食品或保健食品用菌种且具有长期（30 a以上）的使用历史；第二，全基因序列分析结果显示，不存在已知的毒力相关基因或毒素合成关键基因；第三，动物试验显示无致病性；第四，产毒试验结果显示在受试的基质中均不产生有毒活性代谢产物[17]。

如果全基因序列分析发现存在已知毒力基因、动物试验结果显示有致病性以及产毒试验发现菌种可产生有毒代谢物，则此菌株被认为有致病风险，不可以生产保健食品[17]。

2.4 耐药性试验

在安全评价中，益生菌的耐药问题最为突出。对于益生菌而言，适当的耐药性是有益的，不会因为接触到抗生素而受到压制，并且许多益生菌和乳酸菌自身就具有一定的抗性基因。一些乳杆菌属的菌株天然对氨苄西林、万古霉素、环丙沙星等具有抗性，但尚未发现能将其移植到其他菌株中。欧洲食品安全局（EFSA）明确指出，益生菌不能携带可转移的耐药基因。今后，就益生菌的耐药问题而言，研究应着重于研究其有无可转移的耐药基因的存在[19]。

3 益生菌功能性评价方法

研究表明，益生菌具有调节菌群平衡的作用，可以益生保健。许多研究显示，益生菌具有调节人体肠道正常菌群、维持体内微生态平衡、促进食物消化和润肠通便等功能。益生菌还具有降低胆固醇、改善肝功能、缓解乳糖不耐症、抑制肠道内腐败菌的生长繁殖、刺激组织发育等方面的功效[20]。由此可见，随着科技的进步，人们对益生菌的认识和扩大，益生菌为人类健康作出了无可取代的贡献。

《食品益生菌评价指南》中，FAO/WHO对益生菌的功能进行了评估（Functional characterization），其中包含了对胃酸抗性、对胆汁酸的抗性；对肠道上皮细胞的黏附性；对有害致病菌的拮抗性；降低致病菌的黏附性；关于胆汁酸盐的水解能力等。

目前，《允许保健食品声称的保健功能目录 非营养素补充剂（2020年版）（征求意见稿）》中有24项保健功能。其中与益生菌关系最为密切的功能主要是提高免疫力、调节肠道菌群功能和润肠通便[21]。

3.1 有助于增强免疫力

免疫力是指人体在对外防御和对内部环境保持稳定的一种能力，受饮食习惯、生活习惯和心理压力等多种因素影响。目前，有很多研究均表明，益生菌可以增强人的免疫力。评价一株益生菌是否可以对机体的免疫力造成影响，研究人员一般使用正常或免疫功能低下的模型动物进行试验，必做测试指标主要有体质量、脏器/体质量、胸腺/体质量、脾脏/体质量等，还需要研究被测动物的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性，具体包括小鼠脾淋巴细胞转化试验，迟发型变态反应试验、抗体生成细胞检测，血清溶血素测定、小鼠碳廓清试验以及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。如果测试结果显示在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性4个方面任2个方面结果阳性，就可以判定此益生菌菌株可以增强机体的免疫力[22]。

3.2 有助于调节肠道菌群

肠道是人体内最大的内分泌组织，肠道菌群是在肠道内生存的各种各样的细菌群落，与肠道的健康息息相关。肠道菌群一般受饮食习惯、卫生习惯和成长环境等多种因素影响，可将食物分解为短链脂肪酸、次级胆汁酸、氨基酸代谢物等[23]。这些代谢物可直接或间接影响宿主的生理和病理过程，对机体的健康有很大的影响。肠道微生物群紊乱会影响机体的平衡，干扰机体的新陈代谢，破坏肠道上皮细胞，引起炎症，从而导致疾病[24]。普通人群可以通过补充益生菌来增加肠道有益菌的数量，来维持肠道菌群平衡、预防便秘、痢疾、抑制病原菌、抑制大肠杆菌产生的肠毒素、改善乳糖吸收、减轻乳糖不耐受、改善和保持肠道功能、参与新陈代谢、调整免疫系统和内分泌等[25]。

益生菌对胃炎也有很好的疗效。胃酸、胃胀、胃痛等疾病在我国已成为一种普遍疾病，统计显示，超过90%的慢性胃病都是由幽门螺旋杆菌引起的，而益生菌如乳酸杆菌，对幽门螺旋杆菌有很好的抑制作用。

评价益生菌是否有助于调节肠道菌群功能，需要通过动物试验和人体试食试验判断，主要测试指标如表1所示。

表1 动物试验和人体试食试验的主要测试指标Tab.1 The main test indexes of animal tests and human feeding tests

在动物试验中，与对照组相比，双歧杆菌、乳杆菌（或其他益生菌）的数量明显增加，肠球菌、肠杆菌数量无明显变化，梭菌数量减少或无明显变化，可以确定该益生菌菌株可以调节肠道菌群。或者双歧杆菌、乳杆菌（或其他益生菌）的数量明显增加，梭菌数量减少或无明显变化，肠球菌、肠杆菌数量明显增加且增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌（或其他益生菌）增加的幅度，可判定该受试菌株有助于调节肠道菌群功能[26]。

在人体试食试验中，与对照组相比，如果双歧杆菌、乳杆菌（或其他益生菌）数量明显增加，梭菌数量减少或无明显变化，肠球菌、肠杆菌、拟杆菌数量无明显变化，则可以确定该益生菌菌株能够调节肠道菌群。或者双歧杆菌、乳杆菌（或其他益生菌）数量明显增加，梭菌数量减少或无明显变化，肠球菌、肠杆菌、拟杆菌数量明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌（或其他益生菌）增加的幅度，可判定该受试菌株可以调节肠道菌群。

3.3 有助于润肠通便

人体的排便功能受饮食、运动、饮水等因素的影响，科学研究表明，通过补充益生菌，可以促进肠道的排便。为了评估益生菌对润肠通便的作用，必须进行动物试验。研究人员需要对试验动物的体质量、排便时间、粪便质量、粪便颗粒数、粪便性状等进行研究。在动物试验之后，还要进行人体试食试验，并对受试人的症状体征、粪便特征、排便次数、排便情况等数据进行研究。

在动物试验中，粪便质量、粪便颗粒数较对照组呈上升趋势，小肠运动试验及排便时间数据更佳，这说明该菌株对试验动物的润肠通便有着显著的作用。在人体试食试验中，受试者大便次数显著增多，粪便的性质及排便情况也有着显著地改善，这可以判断出该受试菌株对润肠通便起到了改善作用[27]。

4 展望

众所周知，益生菌是一种对人体有益的微生物。在国内外的市场上，益生菌产业的发展呈现出非常好的趋势，并且随着我国经济的不断发展、生活水平的显著提高，消费者的保健意识也随之提高，我国的益生菌保健产品将会成为21世纪一股新的潮流。然而对于益生菌的评估，各国的做法不尽相同，且没有一个统一的标准。此外，对益生菌安全性、功效性的研究与科学评估是一个长期、严谨、科学的过程，应加强大众的科普宣传，科学地使用益生菌的相关产品。新开发的益生菌菌株在产业化前，必须对其安全性进行全面有效的评估。随着益生菌的安全性与功能性评估方法的不断完善，其评估技术也将逐步规范化，最终为我国益生菌产业的健康有序发展作出积极的贡献。