桉树枝瘿姬小蜂体内两种优势细菌对桉树组培苗叶片部分生理指标的影响

劳家鸿蒋腾洋刘光锐杨振德林亿群李俊珏彭小团郑琳柯丁芷柔

(1.广西大学林学院，广西 南宁 530004；2.广西森林生态与保育重点实验室，广西 南宁 530004)

桉树为桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyputs)植物，是我国南方重要的速生丰产树种之一，具有适应性广、抗逆性强、易种植、培育周期短等优点，在提高经济效益和生态效益方面发挥着重要作用[1]。然而调查显示，桉树种植区的生物多样性下降，害虫的种类和数量迅速上升[2]。桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasaFisher＆La Salle)是近年来危害桉树的一种重要外来入侵害虫，隶属膜翅目(Hymenoptera)姬小蜂科(Eulophidae)，成虫可在桉树嫩枝、叶柄及叶脉等处产卵并形成大量虫瘿，严重影响桉树生长发育。研究表明，桉树枝瘿姬小蜂的形态和生理指标受温度和寄主植物条件的显著影响[3]，而桉树能够通过合成大量防御性次生代谢物和激活保护酶来抵御其持续危害[4－6]，因此，探讨两者间的互作机制，可为桉树生产中有效防治该害虫提供参考。

昆虫体内伴生细菌作为与昆虫关系密切的微生物，在昆虫生长发育及繁殖过程中发挥着重要作用，是害虫防治中尚未开发的一类重要生物资源[7]。研究表明，桉树枝瘿姬小蜂伴生细菌可以降解桉树体内的某些防御物质，有助于桉树枝瘿姬小蜂克服桉树抗性[8]。目前已有学者从桉树枝瘿姬小蜂体内分离出了17株不同的细菌菌株，分属于厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)[9，10]。但尚未见关于这些伴生菌对桉树生长发育和生理代谢影响的研究报道。组织培养是植物快繁的一种重要手段，可有效脱除植物所带病毒，且具有成活率高、病虫害少、节本高效等优势，被越来越广泛地应用于实际生产中[11]。本研究以桉树枝瘿姬小蜂体内两株优势细菌的菌液单独或混合喷洒桉树组培苗，通过比较叶片渗透调节物质含量、叶绿素含量、光合和叶绿素荧光参数的差异，初步分析这两种细菌处理对桉树生理代谢的影响，以期为阐明桉树枝瘿姬小蜂与寄主桉树之间的互作关系及该害虫的生物防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试桉树材料为巨园桉DH 201－2(E.grandis×E.tereticornis)的组培苗，高度为28.0～30.0 cm，地径为0.4～0.5 cm，由广西林业科学研究院提供。

供试细菌菌株为N14、E4，均由广西森林生态与保育重点实验室从桉树枝瘿姬小蜂体内分离保存，其中，前者被鉴定为肠杆菌属(Enterobacter)，属革兰氏阴性菌，后者被鉴定为短小杆菌属(Curtobacterium)，属革兰氏阳性菌。

1.2 试验设计与处理方法

试验于2021年10月在广西大学林学教学实践基地进行。设4个处理:CK(对照)，喷洒10 mL清水；N14，仅喷洒10 mL稀释的N14菌液；E4，仅喷洒10 mL稀释的E4菌液；N14＋E4，两种菌液各5 mL混合后喷洒。每处理3个重复，每个重复1盆。

处理方法:将用固体培养基培养的N14和E4菌株菌液调节吸光度到0.5，稀释50倍，根据试验设计，均匀地喷洒在桉树叶上，每隔2天喷洒一次，各处理每次喷洒10 mL，共喷3次，每次喷洒后进行套袋保湿处理。喷洒期间天气晴好，3次喷洒结束后的7 d内只对组培苗基部淋水并进行常规管理，7 d后采集组培苗叶片用于各项指标测定。

1.3 测定项目与方法

采用Li－6400便携式光合分析仪测定光合作用参数；采用调制叶绿素荧光成像系统IMAGINGPAM(上海泽泉科技股份有限公司)测定叶绿素荧光参数；采用研磨－分光光度计法测定叶绿素(Chl)含量；酸性茚三酮法测定脯氨酸(PRO)含量，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量；采用蒽酮－硫酸法测定可溶性糖(SS)含量；采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白(SP)含量[12]。

1.4 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2019软件进行数据统计和图表绘制，采用SPSS 25.0软件进行显著性检验和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 桉树叶片中渗透调节物质和MDA含量的变化

与CK相比，N14处理使桉树叶片中的SS、SP、PRO、MDA含量显著增加；而E4处理除使PRO显著增加外，其余指标均降低，但仅SP降低显著；N14＋E4处理除使PRO含量显著增加外，其余指标均与对照差异不显著(图1)。喷洒菌液处理间比较，N14处理的4种物质含量均显著高于E4处理；N14＋E4处理的4种物质含量均介于N14和E4处理之间，其中，SP和SS含量与两种单菌处理均差异显著，PRO含量与E4处理差异显著，MDA含量与N14处理差异显著。

图1 不同处理下桉树叶片中渗透调节物质和MDA含量变化

2.2 桉树叶片中叶绿素含量的变化

叶绿素是主要的光合色素，其含量高低决定了植物光合阶段对光能的捕获能力，受环境、生物因子等多种因素影响。由图2可知，E4处理下，桉树叶片中的Chl a、Chl b、Chl a＋b含量及Chl a/b值最高，显著高于其它处理；N14＋E4处理次之，除Chl b外均显著高于N14处理，但与CK差异不显著(Chl a除外)；N14处理的各指标最低，除Chl b含量外，其它指标均显著低于CK(图2)。

图2 不同处理下桉树叶片中叶绿素含量变化

2.3 桉树叶片光合指标的变化

由表1可知，与CK相比，E4处理的Pn和WUE显著升高，Ci显著下降，Gs、Tr略高于CK，差异不显著；N14处理的Pn、Gs、Tr、WUE均显著低于CK，而Ci显著高于CK；N14＋E4处理的Pn、Tr显著低于CK，Ci和WUE显著高于CK，Gs与CK差异不显著。三个喷洒菌液处理间，除Tr、WUE外，各指标均差异显著，且N14＋E4处理的各指标值介于N14和E4处理间。

表1 不同处理下桉树叶片的光合指标

2.4 桉树叶绿素荧光参数的变化

由表2可以看出，E4处理的最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光量子产量(Yield)、非光化学荧光淬灭系数(qN)和光化学荧光淬灭系数(qP)、电子传递速率(ETR)最高，除Fv/Fm与CK差异不显著外，均达差异显著水平。N14处理的各指标最低，且显著低于CK。N14＋E4处理的Fv/Fm显著低于CK，与N14处理差异不显著；Yield、qN、qP与CK差异不显著，但显著高于N14处理；ETR显著高于CK和N14处理(P<0.05)。

表2 不同处理下桉树叶片的叶绿素荧光参数

2.5 桉树生理特性的相关性分析

由表3可知，Chl a＋b与Chl a极显著正相关，与Chl b和Chl a/b显著正相关，说明桉树叶片的叶绿素含量主要决定于Chl a含量；Chl a＋b与SS、SP、PRO、MDA均呈负相关，且与SS相关显著，而与除Ci外的其它光合指标和叶绿素荧光参数均呈正相关，且与Pn、Fv/Fm和ETR相关极显著。Chl a/b与qN、qP、Fv/Fm极显著正相关，与Pn、ETR显著正相关，而与SS极显著负相关，与Ci显著负相关。

表3 桉树生理指标间的相关系数

3 讨论与结论

昆虫体内伴生着丰富的细菌、真菌等微生物，其中细菌可为宿主昆虫提供营养物质，合成昆虫所必需的糖类、蛋白质以及维生素等化合物，甚至可以协助宿主入侵[13－16]。本研究用分离自桉树枝瘿姬小蜂体内的两株优势菌(N14、E4)培养液单独或混合喷洒桉树组培叶片，以期通过分析叶片中叶绿素含量、光合特性、叶绿素荧光参数和渗透调节物质含量等指标的变化，初步探究桉树枝瘿姬小蜂与桉树的互作机制。具体研究结果如下。

叶绿素具有吸收光能的作用，其含量与光合作用紧密相关[17]。本研究发现，除Ci外，E4处理能提高桉树组培苗叶片中的叶绿素含量和光合作用参数，而N14处理则使其降低。另外，本研究还发现N14＋E4处理的各指标值居于E4和N14处理之间，这与禹胜男等[18]的研究结论一致，表明混合细菌处理时细菌间存在一定的协同作用。

叶绿素a和叶绿素b在光合作用中发挥着不同的功能。本研究中，E4处理下叶绿素a和叶绿素b含量显著提高，而N14对两者尤其叶绿素a有明显的降解作用，说明两种优势细菌主要通过影响叶绿素a使叶绿素总含量改变。叶绿素a/b在CK和N14＋E4处理下值相当，且高于阳生植物理论值(3.00)；在E4处理下值最高(4.27)，而在N14处理下值最低，且小于3.00，表明E4处理可大幅提高桉树对光的捕获能力，而N14处理则可通过降低叶绿素含量减少对光能的利用，保护光反应中心免受过剩光能的伤害[19，20]。

气体交换参数是反映植物光合能力的表观性状，其中光合速率可直接反映光合作用的强弱，受气孔因素和非气孔因素限制。一般来说，气孔因素限制光合速率时，Gs和Ci同时降低；而非气孔因素限制光合速率时，Gs升高或下降，Ci升高[21]。本研究结果表明，E4处理下，Pn、Gs、Tr均升高，Ci降低，而N14和N14＋E4处理下反之，说明这两种优势细菌通过不同的调节方式影响植株的光合速率，其中E4主要通过增加PSⅡ潜在活性等提高光合效率，N14和混合细菌则主要通过非气孔限制因素来降低光合速率。

叶绿素荧光是光合作用的探针，任何环境因子对光合作用的影响都可以通过叶绿素荧光动力学参数快速、灵敏且无损地反映出来[22]。本研究中，桉树叶片的Fv/Fm、Yield、qN、qP、ETR在N14处理下均显著降低，接近PSⅡ受损临界值[23]，说明PSⅡ潜在活性受到明显抑制[24]；而E4处理下Yield、qN、qP、ETR提高显著，Fv/Fm略有提高，表现出对PSⅡ反应中心活性的明显促进作用。表明两种细菌在对PSⅡ光反应活性的影响上起着相反的作用，因此，两者混合处理的效果介于单独应用时。

PRO、SS、SP是重要的渗透调节物质，其含量增加可以提高植物细胞液的渗透压，增强细胞的吸收保水能力，同时抑制细胞膜脂过氧化，降低膜脂过氧化产物MDA的产生，维护细胞膜稳定性，是植物抵御环境变化的重要生理调节机制[25－27]。本研究中，N14处理下桉树叶片中的PRO、SS、SP、MDA含量显著增加；E4处理下SS、SP、MDA含量降低，PRO含量增加；N14＋E4处理下PRO、SS、SP含量升高，MDA含量略有降低。表明不同菌处理对桉树叶片内渗透调节物质积累的影响不同，PRO可能是桉树应对细菌侵染的主要渗透调节物质。另外，N14处理的叶片中SS大量积累可能为桉树枝瘿姬小蜂提供营养物质，利于其近一步侵害桉树[28，29]；而E4处理下SS下降可能是桉树叶片发生防御反应的结果[29]。

Weidner等研究发现，单细菌和混合细菌处理对植物产生的效应往往不同，尤其是生态位互补型菌株的混合处理可以提高其对植物的正向选择[30]。本研究结果也表明，混合菌株(N14＋E4)处理对桉树组培苗各项生理指标的作用效果介于两个单菌处理之间，倾向于正向作用。

综上所述，桉树枝瘿姬小蜂体内两种优势细菌对桉树组培苗叶片的生理代谢和光合荧光参数均产生了明显影响，E4菌株以正向作用为主，N14菌株以负向作用为主，N14与E4混合处理的作用效果介于二者之间，倾向于正向作用。这可为进一步研究桉树枝瘿姬小蜂与桉树间的侵害－防御机制及生物防治桉树枝瘿姬小蜂提供参考。