基于NLRP3通路研究miR-155对THP-1巨噬细胞炎症反应的调控作用

宁晓县，申元英，郭 乐

（大理大学基础医学院，云南 大理 671000）

炎症是机体对损伤因素产生的一种以防御为主的特异性免疫反应，能消除有害刺激，启动愈合过程。然而炎症反应失控时，会损害正常组织，引起糖尿病、关节炎等慢性炎症性疾病〔1-2〕。活化的巨噬细胞贯穿于炎症性疾病的整个过程，会诱发“炎症风暴”，造成机体严重损伤〔3〕，因此探索巨噬细胞介导的炎症反应分子机制有助于炎症性疾病的治疗。目前体外实验获取人源性巨噬细胞的主要方法是使用佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导人单核细胞白血病细胞株THP-1，进一步用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激，极化为M1型巨噬细胞，分泌大量促炎因子〔4-5〕。

巨噬细胞中的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide binding oligomerization domainlike receptor protein 3，NLRP3）炎症小体可被LPS激活〔6〕。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）组成，其激活有3个步骤：首先，刺激信号激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，使NLRP3和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）前体等蛋白的转录和表达增强；其次，NLRP3寡聚化并与ASC作用，启动炎性体形成；最后，NLRP3炎症小体募集并激活Caspase-1前体，使之活化为Caspase-1，剪切、加工IL-1β前体和白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）前体，使之分别转化为具有生物活性的IL-1β和IL-18，释放到胞外，最终促进炎症反应〔7-9〕。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源基因编码且高度保守的单链非编码小分子RNA，主要参与基因的转录后调控〔10〕。miR-155是一种典型的多功能miRNA，参与炎症、病毒感染、免疫等多种生理和病理过程〔11〕。研究〔12〕发现，miR-155可以靶向抑制THP-1巨噬细胞中NF-κB抑制蛋白E发挥促炎作用。然而，目前尚不清楚miR-155调控THP-1巨噬细胞炎症反应是否与NLRP3炎症通路相关。因此，本研究以LPS诱导THP-1巨噬细胞构建炎症损伤，基于NLRP3通路探讨miR-155的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料人单核细胞白血病细胞株THP-1（上海中科院细胞库，批号：TCHu 57）；PMA（大连美仑生物技术有限公司，批号：MB5349-1）；LPS（爱必信生物科技有限公司，批号：055：B5）；RPMI1640培养基（江苏康宁生物技术有限公司，批号：10-040-CVRC）；胎牛血清（美国Gibco，批号：10270106）；TRIzol试剂（美国Molecular Research Center，批号：TR118）；RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：R323、Q711）；miRNA逆转录试剂盒、miRNA实时荧光定量试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：KR211、FP411）、miRNA-155模拟物（上海生工生物工程股份有限公司）；Lipofectamine TM 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，批号：11668019）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0013C）；PBS、PBST缓冲液、5×蛋白上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号：P1020、T1031、P1040）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010、P0018）；10% PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司，批号：PG112）；兔抗GAPDH抗体、兔抗NLRP3抗体、兔抗Caspase-1抗体、二抗（美国Cell Signaling Technology，批号：2118、13158、3866、7074）；PVDF膜（BIO-RAD，批号：1620177）；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司）；迷你垂直电泳仪、迷你转印槽（韦克斯科技有限公司）；化学发光成像系统（美国GE ImageQuant LAS4000）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养RPMI1640培养基中加入10%胎牛血清培养THP-1细胞，将其置于37℃、5%CO2培养箱，细胞密度达80%~90%时，传代培养。

1.2.2 炎症模型构建THP-1细胞处于生长旺盛期并且状态良好时，以1×105个/mL的密度接种于48孔板中，PMA（100 ng/mL）刺激48 h，诱导分化为巨噬细胞；LPS（100 ng/mL）刺激1.5 h，构建炎症损伤模型。

1.2.3 实验分组 细胞分为4组：空白对照组、LPS组、miR-155过表达组（以下简称“过表达组”）和miR-155阴性对照组（以下简称“阴性对照组”）。细胞培养计数铺板，PMA诱导48 h。不做任何处理的为空白对照组；LPS处理1.5 h为LPS组；miR-155模拟物处理36 h，再用LPS处理1.5 h为过表达组；miR-155模拟物的阴性对照处理36 h后用LPS处理1.5 h为阴性对照组。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测THP-1巨噬细胞中miR-155及IL-1β、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和NLRP3的表达 细胞按以上分组铺板，每组设置3个复孔，转染刺激以后，按照TRIzol试剂说明书提取总RNA；按说明书反转录制备cDNA，并用实时荧光定量PCR仪进行扩增，检测miR-155以及IL-1β、TNF-α和NLRP3的表达。miR-155反应程序：95℃预变性15 min；富集低丰度目标miRNA：94℃20 s，65℃30 s，72℃34 s，5次循环；94℃变性20 s；60℃退火、延伸34 s；其中变性、退火延伸45次循环。IL-1β、TNF-α和NLRP3反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性10 s；60℃退火30 s；其中变性、退火步骤40次循环。引物序列见表1。分别选择u6和gapdh为内参基因，获得Ct值后，用2-△△Ct法对目的基因进行定量计算。

表1 实时荧光定量PCR实验引物序列

1.2.5酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测上清液中IL-1β和TNFα的分泌量 收集细胞上清液于EP管中，根据ELISA试剂盒说明书，分别检测上清液中IL-1β和TNF-α的分泌量，用酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD）值，根据标准曲线计算检测物质的实际浓度。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blot，WB）分析蛋白表达THP-1细胞接种于6孔板，转染刺激后，每孔加入RIPA裂解液，立即将6孔板水平放于冰上30 min，提取总蛋白进行超声裂解，并于4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定上清液中蛋白的浓度，将蛋白样品与蛋白上样缓冲液充分混匀，100℃金属浴10 min使蛋白充分变性。蛋白样品选取10% SDS-PAGE恒压120 V电泳，250 mA电流下转到PVDF膜上，封闭液（5%脱脂奶粉）封闭1 h，PBS缓冲液洗膜3次后加入相应一抗，放于4℃冰箱孵育。次日，PBST缓冲液洗膜后加入二抗孵育1 h，再洗膜3次，经ECL发光液显色，化学发光成像系统曝光得到蛋白条带，使用Image J软件半定量分析条带灰度值，将蛋白条带导入软件Image J转化为灰度图片，并消除图片背景的影响，设置定量参数以及单位，将蛋白条带转换成亮带，手动框选各个蛋白泳道测量得到灰度值，计算目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值的比值，即可得到目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 统计分析 实验数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行处理，计量结果用（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS促进THP-1巨噬细胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3以及miR-155的表达实时荧光定量PCR结果显示，经LPS处理后，细胞中IL-1β、TNF-α和NLRP3在mRNA水平的表达升高，说明炎症模型构建成功；同时，在LPS诱导的炎症中，miR-155的表达上调。见图1。

2.2 miR-155促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3的表达实时荧光定量PCR结果显示，miR-155模拟物处理细胞后，其表达显著升高，证明转染成功。见图2A。此外，过表达miR-155，增强了LPS诱导的细胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3的表达。见图2B～D。

2.3 miR-155促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞中IL-1β、TNF-α的蛋白表达量将收集的上清液用于ELISA实验，结果显示，经LPS刺激，细胞中IL-1β和TNF-α的分泌量增加。过表达miR-155，LPS刺激的IL-1β和TNF-α蛋白表达水平的升高更显著。见图3。

2.4 miR-155促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞中NLRP3、Caspase-1蛋白的表达分别检测NLRP3信号通路中NLRP3和Caspase-1蛋白的表达情况。结果显示，LPS刺激后细胞中NLRP3和Caspase-1蛋白表达上升；过表达miR-155，LPS刺激的NLRP3和Caspase-1蛋白的表达水平显著增加。见图4。

3 讨论

炎症反应在机体疾病的发生发展中扮演着重要角色，多种炎症细胞和炎症因子参与该过程，其中巨噬细胞作为固有免疫的首道防线，表达甘露糖受体、清道夫受体、Toll样受体、补体受体、细胞因子受体以及主要组织相容性复合体等多种表面标志物，具有识别并清除异物、促进炎症反应、杀伤肿瘤和病毒感染细胞、提呈抗原和免疫调节等作用，在炎症反应中处于核心地位。巨噬细胞被LPS刺激后，可极化为M1型巨噬细胞，产生和分泌IL-1β和TNF-α，导致炎症损伤〔13-14〕。IL-1β和TNF-α是介导炎症反应的重要炎症因子，检测IL-1β和TNF-α的含量可以得知细胞是否处于炎症状态，基于以上基础，本研究参考Maess等〔5〕的方法，使用100 ng/mL PMA刺激THP-1细胞48 h，将其诱导分化为巨噬细胞，并用LPS刺激，结果发现，巨噬细胞中IL-1β和TNF-α表达显著升高，说明成功构建炎症损伤模型，并验证了LPS具有促炎和诱导巨噬细胞极化的作用〔15〕。

据报道〔16〕，IL-1β是NLRP3炎症小体的下游因子，NLRP3是一组广泛存在于巨噬细胞、树突状细胞和其他一些免疫细胞中的多蛋白复合物，作为先天免疫的主要组成部分，NLRP3在正常情况下处于失活状态，当细胞受到LPS刺激被损害时，NLRP3则被激活并呈递信号，诱导IL-1β等炎症因子释放，启动炎症反应。NLRP3在多种常见的炎症性疾病中发挥关键作用，在骨关节炎中，羟基磷灰石晶体能够激活IL-1β并通过NLRP3炎症小体促进其产生，从而介导炎症和关节疾病〔17〕；在动脉粥样硬化伴巨噬细胞浸润的炎症反应中，NLRP3炎症小体被激活后，通过促进IL-1β释放，最终导致动脉粥样硬化的进展〔18〕。因此，NLRP3炎症小体被认为是治疗许多与炎症相关疾病的有望靶点。同样，本实验检测到IL-1β上调之后，继续检测NLRP3炎症小体mRNA水平的表达，发现其表达也升高，这一结果与之前的报道一致〔6〕，并为后续的实验提供了依据。

miRNA是一类非编码小分子RNA，通过抑制mRNA翻译或促进mRNA降解来调节基因转录后的表达水平〔19〕。目前研究〔20〕发现多种miRNA在炎症性疾病中异常表达，并且通过调节信号通路影响炎症因子和炎症性蛋白的表达，从而参与炎症反应的发生发展，其中NLRP3研究较为广泛。例如：miR-21正向调节巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活，促进IL-1β分泌和Caspase-1活化，最终促进LPS诱导的细胞焦亡和感染性休克；在肾脏炎症中，miR-10可以靶向抑制NLRP3炎症小体的组装，抑制Caspase-1切割和IL-1β成熟，使促炎因子TNF-α和白细胞介素6的释放减少，减轻细胞的损伤和凋亡〔21〕。由此可知，miRNA可通过调节NLRP3来影响炎症的进展，故此，本研究旨在探索在THP-1巨噬细胞炎症反应中，NLRP3的激活是否也受miRNA的调控。

在miRNA家族中，miR-155在多种激活的细胞中异常表达，与炎症反应密切相关，据报道用LPS诱导人单核细胞，在miRNA基因表达谱中发现miR-155表达上调〔22-23〕，本实验使用LPS刺激THP-1巨噬细胞后，发现miR-155表达上调，与上述实验结果一致。此外，Fan等〔24〕研究表明，在骨关节炎中，miR-155通过靶向和抑制PIK3R1的表达调控PI3K/Akt通路，最终促进IL-1β诱导的体外软骨细胞凋亡和分解代谢活性；在THP-1细胞中，过表达miR-155会抑制肿瘤抑制因子SHIP1的表达，进而激活Akt信号通路，导致肿瘤的发生〔25〕。由此可知，在炎症反应中，miR-155可通过不同的机制发挥调控功能。本研究中，在LPS刺激构建的体外炎症模型中过表达miR-155，发现THP-1巨噬细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α的表达显著升高，NLRP3炎症小体通路相关蛋白NLRP3和Caspase-1的表达也升高，由此可知，miR-155可以通过激活其潜在靶点NLRP3信号通路促进炎症反应。

本研究初步探讨发现miR-155可以激活NLRP3信号通路，促进LPS诱导的THP-1巨噬细胞中炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，因此通过靶向抑制miR-155/NLRP3轴，可为治疗炎症性疾病提供新思路。