高晓斌 武雪亮 赵轶峰 聂双发 梁 峰 张迎春
河北北方学院附属第一医院普通外科,河北张家口 075000
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤,具有高度侵袭性,治疗选择有限且5 年生存率较低,因此迫切需要寻找有效的分子生物标志物,这些生物标志物可以促进早期检测或肿瘤对特定疗法的反应,以降低死亡率。Piwi 相互作用RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA)是一种新型的RNA 干扰家族,已被证明是癌症早期检测和治疗的有效生物标志物[1-4]。与微RNA 和小干扰RNA 不同,piRNA 的特征是具有21~35 个核苷酸的单链小非编码RNA 沉默子,带有2’-O-甲基修饰的3’末端并与Piwi 蛋白结合形成功能性沉默复合物[5-6]。piRNA 的失调发生在多种癌症中,例如多发性骨髓瘤、乳腺癌、食管癌[7]。基于piRNA 在癌症样本中的表达差异可以将癌症患者与健康人群区分开,其检测灵敏度高于癌胚抗原和糖类抗原19-9[8-9]。此外,手术前后患者piRNA 的表达变化可用于术后长期监测和疾病进展指标[10]。而本研究则旨在探究piR-128 在结直肠癌中发挥的生物学作用及其对DNA 甲基化酶(DNA methylase,DNMT)3B 的调控作用。
选取2018 年2 月至2020 年1 月于河北北方学院附属第一医院(以下简称“我院”)普通外科诊断为结直肠癌的54 例患者的手术标本,包括其结直肠癌组织和匹配的正常组织(距肿瘤边缘3~7 cm),且经我院病理科病理诊断。参照美国癌症联合委员会对研究对象进行TNM 分期[7],根据《中国结直肠癌诊疗规范》[10]评估其组织学等级。纳入标准:①在我院普通外科行手术治疗;②年龄≥18 岁;③首次诊断。排除标准:①合并其他系统肿瘤;②采用化学疗法或放射疗法;③孕妇。本研究获得我院伦理审查委员会批准(伦审:K20150212)。
使用Trizol(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,美国)从人类组织或细胞中提取总RNA,通过Nanodrop 2 000(Invitrogen,美国)定量总RNA,使用miScript 逆转录(RT)试剂盒(Qiagen GmbH,美国)生成cDNA,使用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen,美国)进行qRT-PCR,U6 用作内部对照,PCR 反应在ABI7500 FAST 实时PCR 系统(Applied Biosystems,美国)上进行,反应条件:变性95℃,30 s;退火58℃,1.0 min;延伸72℃,1.5 min;35 个循环。通过比较交叉阈值(Ct)方法计算相对表达,并使用Graph Pad Prism v.5 进行数据分析,引物序列见表1。观察癌组织和邻近正常组织中piR-128、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 水平的差异,分析其与DNMT3B 的相关性,再进一步分析不同piR-128、DNMT3B 水平患者与其临床特征的关系。
表1 引物序列
1.3.1 细胞培养和转染 人结直肠癌细胞LIM1215 购自美国典型收藏物保藏中心的细胞库,在补充10%FBS(Invitrogen,美国)的RPMI1640 培养基(赛多利斯生物试剂,德国)中培养,按照试剂盒说明书Lipofectamine 2 000 转染试剂进行空白(对照组)、piR-128 抑制剂(piR-128 抑制剂组)、si-DNMT3B(si-DNMT3B组)、piR-128 抑制剂+DNMT3B Vector(抑制剂+Vector组)的转染,转染后48 h 收获细胞用于后续实验,所用材料均购自浙江格鲁斯特生物技术公司。
1.3.2 Western blot 将细胞与300 μl RIPA 裂解液(博拓生物科技股份有限公司,中国)和苯甲磺酰氟(PMSF,博拓生物科技股份有限公司,中国)在冰上放置30 min 以裂解细胞,获取上清液后使用BCA 蛋白质浓度测定试剂盒(博拓生物科技股份有限公司,中国)测量蛋白质裂解物浓度,通过SDS-PAGE 分离总共40 μg 的蛋白裂解物,然后转移到PVDF 膜上,用5%封闭缓冲液封闭膜2 h 后,将膜与抗DNMT3B 和GAPDH 的一抗(1∶500)在4°C 下免疫印迹过夜,然后用HRP 偶联的二抗(1∶200)室温孵育2 h,最后,使用ECL Super Signal West Pico 套件进行信号检测。
1.3.3 增殖测定 将细胞以3 000 个细胞/孔的密度接种在96 孔板中,各组转染24 h 后将10 μl CCK8试剂添加到37℃的普通培养基中反应2 h,然后分别在0、12、24、36、48、72 h 时通过酶标仪(Rayto,中国)记录450 nm 处的吸光度,各做5 次重复实验。
1.3.4 transwell 实验 在37℃下将40 μl 的Matrigel(1 μg/μl,BD Biosciences,美国)添加到transwell 上室预先包被2 h,各组转染24 h 后将100 μl 细胞悬液接种到上腔室中,并将600 μl 完全培养基添加到下腔室中,孵育24 h 后,将下部小室中的细胞用4%多聚甲醛固定15 min,然后用5%结晶紫染色,用棉签涂抹器除去上腔室中未迁移的细胞,拍摄代表性图像,并对5 个随机视野中的细胞进行计数计数,观察细胞侵袭个数,各做5 次重复实验。
1.3.5 划痕实验 将细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在6 孔板中,各组转染24 h 后使用200 μl 无菌移液器进行划痕,各做5 次重复实验,用磷酸盐平衡盐溶液洗涤后,将细胞在补充有1% FBS 的RPMI 1640 培养基中培养24 h,在Leica 显微镜对伤口愈合进行成像,观察细胞迁移率(迁移宽度/总宽度)×100%。
1.3.6 流式细胞仪 各组转染24 h 后收集细胞并以1×105个细胞/ml 的密度重悬于结合缓冲液中,用5 μl Annexin V-APC 和5 μl 7-AAD 进行双重染色后,按照生产商的说明使用Cyto FLEX 流式细胞仪(Beckman Coulter,美国)对细胞进行分析以检测细胞凋亡,各做5 次重复实验。
采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差()表示,比较采用t 检验;不符合正态分布的计量资料采用散点图表示,比较采用非参数检验。计数资料采用例数表示,比较采用χ2检验。采用Spearman 相关系数分析相关性,受试者操作特征曲线分析诊断价值。以P<0.05 为差异有统计学意义。
结直肠癌组织中piR-128、DNMT3B mRNA 的表达水平高于邻近正常组织,差异有统计学意义(P <0.05)。相关性分析结果显示,结直肠癌组织中piR-128 与DNMT3B mRNA 表达水平呈正相关(rs=0.574,P <0.001)。见图1。
图1 结直肠癌组织与邻近正常组织中piR-128、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 表达比较及piR-128 与DNMT3R 的相关性分析
以piR-128 相对表达水平的中位数将患者分为piR-128 高表达患者(>2,39 例)和piR-128 低表达患者(≤2,15 例),结果显示piR-128 表达水平与临床特征无关(P >0.05)。见表2。以DNMT3B mRNA 相对表达水平将患者分为DNMT3B 高表达患者(≥1,35 例)和DNMT3B 低表达患者(<1,19 例),相关性分析结果显示DNMT3B 表达水平与患者临床病理特征之间无关(P >0.05)。见表3。
表2 不同piR-128 水平患者与其临床特征的关系(例)
表3 不同DNMT3B 水平患者与其临床特征的关系(例)
piR-128 诊断结直肠癌的截断值为3.52,曲线下面积为0.713(95%CI:0.615~0.810,P <0.001),约登指数为0.398,灵敏度为62.9%,特异度为76.9%。见图2。
图2 piR-128 诊断结直肠癌的受试者操作特征曲线
piR-128 抑制剂组、抑制剂+Vector 组piR-128、DNMT3BmRNA 水平低于对照组,si-DNMT3B 组DNMT3BmRNA 水平低于对照组,抑制剂+Vector 组DNMT3BmRNA 水平高于si-DNMT3B 组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3A。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组、DNMT3B 蛋白水平低于对照组,抑制剂+Vector 组DNMT3B 蛋白水平高于si-DNMT3B 组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3B。si-DNMT3B 组、piR-128 抑制剂组、抑制剂+Vector 组在24、36、48、72 h 的吸光度均低于对照组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3C。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组细胞侵袭能力均低于对照组,抑制剂+Vector 组高于piR-128 组、si-DNMT3B 组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3D。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组细胞迁移率均低于对照组,抑制剂+Vector 组高于piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3E。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组细胞凋亡率均高于对照组,抑制剂+Vector 组低于si-DNMT3B 组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图3F。
图3 四组细胞piR-128、DNTM3B 表达水平及细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡情况比较(n=5)
先前研究表明,piRNA 是一种重要的生物标志物,在多种人类癌症中失调[11-13]。piR-128 在包括乳腺癌、食管癌、肝癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤在内的癌症中上调[14-19],在胃癌和肾癌中表达则下调[20-21]。本研究结果显示,piR-128 在结直肠癌组织中表达水平显著升高,并可通过DNMT3B 发挥促癌作用。
在转录后水平上,piRNA 可诱导mRNA 降解及蛋白质磷酸化或泛素化调控癌症的发生和进展[22-24],机制分析表明,piR-128 通过与其共同转录因子HSF1结合并诱导其在Ser326 位点磷酸化,同时促进HSP27、HSP60、HSP70 的表达,从而促进结直肠癌的增殖而抑制凋亡。本研究在结直肠癌中观察到piR-128 和DNMT3B 的过表达,以及piR-128 和DNMT3B 呈正相关,据此假设piR-128 可能通过DNMT3B 激活异常DNA 甲基化,本研究的细胞实验部分提示,该假设可能为piR-128 的促癌机制。piRNA 在细胞恶性表型(细胞增殖、逃避细胞凋亡、转移、侵袭和细胞周期停滞)中具有调节作用,例如肺癌细胞中piRNA-128 敲低可抑制血管内皮生长因子的分泌,从而引发促血管生成活性[16-18]。此外,piRNA-128 抑制剂可抑制肺癌细胞外囊泡对内皮细胞的促增殖和抗凋亡作用,伴随着上调凋亡相关蛋白和活性氧的产生及下调一氧化氮的产生[21]。而抑制piR-128 可导致结直肠癌细胞系增殖抑制、细胞周期停滞在G1期和细胞凋亡诱导[20]。而本研究中,一系列的体外实验结果显示,piRNA-128 可以在结直肠癌细胞中发挥促癌作用,在使用piRNA-128 抑制剂转染后,DNMT3B 过表达可以逆转piRNA-128 抑制诱导的癌细胞增殖,癌细胞转移能力抑制和细胞凋亡增加,提示piRNA-128 的促癌作用需要通过DNMT3B 来发挥。
综上,本研究提示,piR-128 和DNMT3B 在结直肠癌中上调,较高水平的piR-128 与DNMT3B 表达呈正相关,体外实验则提示piR-128 可以通过上调DNMT3B表达发挥促癌作用,piR-128 在结直肠癌中的诊断和预后生物标志物潜力。