水稻白叶枯病抗性相关基因的研究进展

陈 贤， 赵延存， 明 亮， 杨 勇， 刘凤权

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，江苏南京210014；2.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州310021)

由革兰氏阴性黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)引起的水稻白叶枯病(BB)严重危害水稻生产，是世界性的十大植物病害之一[1-2]。Xoo属于γ-变形菌纲，呈短杆状，在菌体一端有1根线状鞭毛。在自然环境中，Xoo主要侵染水稻，也可侵染李氏禾、马塘、茭白、野生稻、紫云英、看麦娘及草芦等植物[3-4]。病原菌可入侵水稻叶片、种子等组织部位，并随种子调运实现远距离的传播和扩散。在侵染循环中，Xoo可通过农业灌溉水、暴风雨等媒介接触秧苗，从伤口和水孔进入水稻维管束，最后引起系统性侵染[5]。水稻白叶枯病于1884年在日本发现，随后该病害在全球各主要水稻栽培地区均有发生的报道，在中国，该病害在水稻主产区都发生过，且以华南、华中及华东等稻区较为严重，北方稻区局部发生[6]。

水稻白叶枯病在水稻的整个生长周期内均可发生，且以水稻的孕穗期最为严重[7]。Xoo侵染寄主后可使抽穗延迟，穗形变小，秕谷增多，一般减产10%～50%，发病严重时绝收[8]。水稻白叶枯病的症状与品种抗性、发病条件、侵入时期、侵染部位等有关。水稻白叶枯病的症状有4种类型，包括：叶枯型、黄化型、凋萎型和急症型，以叶枯型最为常见[2]。水稻白叶枯病从潜伏到发生具有突发性快、对产量影响大等特点。20世纪80年代至90年代初期，是水稻白叶枯病在中国重发、流行时期,其中，1980年发生面积1.60×106hm2，稻谷损失超过4.50×105t[9]。近年来，随着水稻品种的变化和稻种的南繁北调、灾难性天气频发和病原菌致病性的变异、栽培方式的变化等，水稻白叶枯病在华南、华东及华中等稻区的发生有潜在上升趋势[10-11]。据统计，2017年中国水稻白叶枯病的发生面积超过6.67×105hm2[10]。

1 水稻白叶枯病主效抗病基因

截至2022年1月，经文献报道和国际注册确认的水稻白叶枯病主效抗病基因共有46个，包括：17个隐性基因，29个显性基因[12]。其中，36个基因已被定位，10个基因(OsXa1、Osxa5、OsXa7、OsXa10、Osxa13、OsXa21、OsXa23、OsXa25、OsXa26、OsXa27)已被成功克隆(表1)。在已被克隆的抗病基因中，OsXa21来自于西非长药野生稻(Oryzalongistaminata)，OsXa23来自中国普通野生稻(Oryzarufipogon. Griff)，OsXa27来自中国小粒野生稻(OryzaminutaAcc.No: 101133)[13]。

表1 已经克隆的水稻抗白叶枯病基因

OsXa21、OsXa23和OsXa27为广谱抗性基因。OsXa21是一个编码LRR-RK受体类蛋白激酶的主效抗病基因[14]，是在水稻育种中被广泛运用的抗病基因之一。OsXa21对国内和国际上的Xoo生理小种均表现为高抗。OsXa21与avrXa21(RaxX)互作后，其带有核定位的激酶区域与OsWARKY64互作，进而激活水稻防御基因的转录，增强水稻抗病性[15]。OsXa23为广谱全育期抗性基因，由章琦等[13]从普通野生稻中鉴定获得。OsXa23最为可能的候选基因是LOC_OS11g37620，对该基因的研究尚处在功能验证阶段[16]。OsXa27为广谱抗性基因，受avrXa27诱导表达，且表达仅限于侵染区域。在感病材料中，avrXa27可抑制宿主过敏性反应(HR)的发生，并操纵糖转移蛋白来获取营养[17]。

Osxa5、Osxa13均为隐性基因。Osxa5是一个编码TFIIAγ类转录因子的抗性基因[18]。Osxa5与其等位基因OsXa5仅存在2个碱基的差异：Osxa5第39号氨基酸为疏水性缬氨酸，OsXa5第39号氨基酸为亲水性谷氨酸。携带Osxa5的抗病材料和携带OsXa5的感病材料接种Xoo后，病原菌在抗病材料中的扩散速率明显低于感病材料，推测抗性基因Osxa5可能通过减缓病原菌在维管束中的扩散转移速率使寄主表现出抗性。Osxa13为隐性抗病基因，OsXa13为感病基因[19]。OsXa13的启动子区域可被pthXo1专一化识别，激活的OsXa13与CopT1、CopT5互作，可将铜离子从维管束中移到外部，维持维管束内部的低铜离子环境，促进病原菌的增殖、扩散[20]。在携带Osxa13的抗病材料中，Osxa13启动子区域不能被pthXo1识别，造成病原菌无法操控寄主的免疫反应，最终使得水稻抗病，推测启动子区域的差异可能是造成抗病和感病差异的主要因素。OsXa25是一个显性抗病基因，为组成型表达模式。Osxa25和OsXa25均编码一个MtN3家族蛋白[21]，它们之间仅有8个氨基酸不同，而在启动子区域没有差别，推测二者在蛋白质结构上的差异可能是造成抗病和感病差异的主要因素。

OsXa1、OsXa21及OsXa26均为编码受体类蛋白激酶的抗性基因。OsXa1为具核苷酸结合位的亮氨酸富集结构域(NBS-LRR)类蛋白质，无跨膜结构域[22]。OsXa1在感病材料中不表达，只在抗病品种中受Xoo和机械损伤的诱导表达，且对日本的水稻白叶枯病菌生理小种1号表现为专一性高抗。推测，病原菌某个未知的无毒蛋白质可通过诱导OsXa1的表达来增强水稻抗病性。OsXa26为富亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RK)，对水稻白叶枯病菌JL691生理小种表现为专一性抗性[23]。Osxa26为持家基因，且仅在维管束内表达。在感病材料中，Osxa26与其等位基因OsXa26只在富含亮氨酸片段(LRR)区域有差异。推测，该区域的微小变化可能造成二者在抗性上的巨大差别。

OsXa10是一个编码六聚体蛋白的抗病基因，定位于内质网且受AvrXa10诱导表达[24]。OsXa10被激活后参与细胞内钙离子泄漏以及内质网崩解，进而启动细胞程序性死亡，阻断病原的增殖和扩散，最终增强水稻抗病性。

2 水稻白叶枯病抗病相关基因

在水稻与Xoo识别、互作的过程中，除了46个主效抗病基因参与之外，抗病相关基因也参与了水稻的抗病性。与主效抗病基因不同，多数抗病相关基因介导的抗病性大多没有生理小种特异性。一般情况下，抗病相关基因多数位于抗病信号传导的下游，故而其抗病性比主效抗病基因低[28]。据不完全统计，有超过16个抗病相关基因参与水稻对白叶枯病的抗病性(表2)。

表2 已经克隆的水稻抗白叶枯病相关基因

OsCDR1和OsWRKY45均受水杨酸(SA)和苯并噻二唑(BTH)诱导表达[29-30]。OsCDR1是一个组成型抗病相关基因，编码一个天冬氨酸蛋白酶[31]。在转基因植株中，过表达OsCDR1可促进SA的合成，并诱导防御蛋白PR1和PR2的表达，最终增强水稻对白叶枯病的抗病性。OsWRKY45是一个编码WRKY转录调控因子的抗性基因[30]。在转基因水稻中过表达OsWRKY45，磷酸化后的OsWRKY45会激活其转录调控活性，调控防御基因的表达，最终增强水稻的防御能力。OsSnL6介导的抗病性也与SA信号途径相关。OsSnL6是一个编码类肉桂酰辅酶A还原酶的抗病相关基因[32]。在NPR1同源蛋白(NH1)抗性植株中，抑制OsSnL6的表达可下调病程防御基因的表达量，并增强水稻对白叶枯病的感病性。有关OsSnL6介导NH1的抗病信号网络仍需进一步解析。

OsXB24、OsXb3、OsBiP3、OsWRKY62在OsXa21基因介导的水稻白叶枯病免疫反应中具有重要作用。OsXB24是OsXa21的受体，负调控OsXa21介导的抗病性。在水稻中沉默OsXB24，可增强水稻对Xoo的抗病性[33]。相反，在水稻中过表达OsXB24，OsXa21被OsXB24磷酸化后降解，使得水稻感病。OsXb3是一个编码泛素连接酶E3的抗病基因，泛素化OsXa21[34]。理论上，OsXb3下调表达应该会增加OsXA21的积累。在沉默OsXb3感病植株中，OsXa21积累量是减少的，具体的机制未知。OsBiP3是一个编码热激蛋白HSP70的抗病性相关基因，参与OsXa21蛋白的稳定性和折叠[35]。OsWRKY62是编码一个转录因子的抗病性基因，负调控OsXa21介导的水稻基础抗病性[36]。在过表达OsWRKY62的转基因植株中，防御基因的表达均受到抑制，最终使得水稻丧失抗病性。

OsLOL2和OsSpL28均参与细胞程序性死亡。OsLOL2是锌指蛋白家族的抗性蛋白，参与调控水稻抗病性[37]。在水稻中过表达OsLOL2，PR1等防御基因的表达量均上调，株系表现为抗水稻白叶枯病。OsLOL2参与调控水稻细胞程序性死亡，而OsLOL2参与的水稻抗病性是否与细胞程序性死亡有关，需进一步研究。OsSpL28是一个编码斑点叶蛋白的抗病相关基因[38]，它编码的蛋白质定位于高尔基体膜上，参与调控囊泡运输。在OsSpL28突变的抗病性植株中，过氧化氢在斑点周围大量积累并形成过敏性反应，抵御病原菌的侵入，具体的信号网络未知。

OsPdk1、OsOXi1和OsMPK6均为激酶基因。OsPdk1是一个编码3-磷酸肌醇(PI3)依赖性蛋白激酶的抗病相关基因[39]。过表达OsPdk1可以增强水稻抗白叶枯病。OsPdk1位于OsOxi1-OsPti1a信号上游，与OsOxi1互作，正调控水稻的基础抗病性。OsOXi1是一个编码丝氨酸/色氨酸激酶的抗病性基因[40]。在过表达OsOXi1的抗病性植株中，OsOXi1通过磷酸化OsPti1a调控水稻的基础免疫反应。突变OsOXi1第233号氨基酸位点则使水稻感病。OsMPK6是编码一个有丝分裂原活化蛋白激酶的抗病性基因，负调控水稻的防御反应[41]。OsMPK6在水稻抗白叶枯病中发挥双面作用，既是激活子又是抑制子[41-42]。在沉默或敲除OsMPK6的转基因抗病性植株中，参与水稻防御相关基因的表达均上调；相反，在水稻中过表达OsMPK6，参与寄主防御相关基因的转录水平均受到抑制，具体的机制未知。

OsrTGA2.1是一个编码转录因子的抗病性相关基因[43]。在OsrTGA2.1沉默的抗病性增强植株中，大部分防御基因均上调表达，暗示该基因可能负调控水稻的抗病性。OsDR8是一个合成硫胺素的抗病性相关基因，位于抗病信号上游[44]。在敲除OsDR8的抗病性丧失植株中，大部分防御基因均下调表达，推测该基因通过调控防御基因的表达参与水稻抗性。OsGH3-8是一个编码调控生长素活性的抗病性相关基因[45]。OsGH3-8通过抑制生长素活性阻止细胞壁松弛，从而增强水稻的抗病性。OsHPL3是一个编码过氧化氢裂解酶的抗病性相关基因[46]。在OsHPL3突变的抗病性植株中，茉莉酸(JA)的合成途径和信号途径均被激活，具体的信号网络未知。

3 水稻感病基因

水稻抗病性是由基因决定的一种生物学特性，由寄主和病原菌共同形成[50]。当病原菌无毒基因识别水稻抗病性基因时，会诱导植株产生抗病性。相反，当无毒基因识别感病基因时，则会导致植株感病。

目前，水稻中的感病基因分为2类：一类是SWEET基因家族的第三亚族基因成员，包括：OsSWEET11/OsXa13、OsSWEET12、OsSWEET13/OsXa25、OsSWEET14和OsSWEET15；另一类是转录因子[51-52]。SWEET家族是一类参与蔗糖及单糖运输的糖转运蛋白，具有典型的MtN3/saliva跨膜结构域[53]。据推测，水稻基因组中SWEET基因数量超过21个。在SWEET类基因中，病原菌TALE效应蛋白被分泌运输到寄主细胞后，能直接特异结合其启动子序列并调控SWEET的表达，促进蔗糖合成，并在维管束中积累，这些蔗糖为病原菌的生长和增殖提供了丰富的营养，最终使得水稻感病[54]。例如：水稻白叶枯病菌TALE效应蛋白可识别Xa13的启动子区域，操控它的表达，进而使得水稻感病。相反，如果xa13的启动子发生了变异而无法被病原菌TALE效应蛋白所识别，则无法诱导它们表达，水稻表现抗病[55-56]。因此，利用基因编辑技术对SWEET家族基因的启动子进行编辑修饰后，也可以创制广谱抗水稻白叶枯病的新品种[51]。

4 水稻抗病性基因与白叶枯病菌无毒基因的互作机制

水稻与病原菌Xoo的互作机制符合Flor[57]提出的基因-基因假说。当病原菌相对应的毒性基因(vir)或无毒基因(avr)被水稻抗病基因(R)感知识别时，能在侵染区域激发强烈的免疫反应，限制病原菌的生长、增殖和扩展，水稻表现为抗病[58]。例如，avrxa5-Osxa5[59]、avrXa7-OsXa7[60]、avrXa10-OsXa10[24]、avrXa27-OsXa27[61]、avrXa23-OsXa23[16]、avrxa13-Osxa13[55]、raxX-OsXa21[62]、pthXo6-OsTFX1[63]、pthXo7-OsTFIIAγ[64]和pthXo8-OsHen1[65]等(表3)。其中，avrXa7-OsXa7、avrXa10-OsXa10及avrXa27-OsXa27研究的比较深入。

表3 水稻抗病基因及其对应的病原菌无毒基因

OsXa7是一个显性抗病基因，对中国华南稻区携带AvrXa7的病原菌具有较高的抗性[25]。水稻白叶枯病菌AvrXa7蛋白被OsXa7识别后，在侵染区域可快速触发免疫防御反应，最终阻断病原菌扩散[60]。OsXa10也是一个显性抗病基因，并受AvrXa10调控。激活的OsXa10参与钙离子泄露和程序性细胞死亡，诱导水稻产生过敏性反应[27]。如果病原菌不携带AvrXa10，则携带Xa10基因的株系表现为感病。

OsXa27也是一个显性抗病基因，对携带Ⅲ型效应因子基因AvrXa27的病原菌表现为专一抗性[66]。在抗病材料和感病材料中，OsXa27的编码区域完全相同，二者在启动子区域有10个碱基的差异[17]。AvrXa27可诱导抗病材料中OsXa27的表达，而在感病材料中OsXa27则不表达。推测启动子区域的差异是造成二者差异的主要因素。在携带OsXa27的抗病材料中，OsXa27识别病原菌的AvrXa27后，在维管束细胞中大量表达，最终将病原菌限制在侵染区域[61]。相反，在携带OsXa27的感病材料中，由于病原菌无法成功诱导激活OsXa27的表达，最终使得寄主感病。

5 水稻对白叶枯病菌的主要防御机制

水稻与病原菌互作的过程中形成了许多防御体系，一般可分为诱导型防御体系和组成型防御体系[68]。诱导型防御体系由获得性系统抗病性(SAR)和诱导性系统抗病性(ISR)组成，是水稻抵御病原菌侵染的第二类防御系统，是水稻的先天性免疫系统[69]。组成型防御体系是水稻抵御病原菌侵染的第一道防线[2]，它主要由物理屏障(结构抗病性)和化学屏障(生化抗病性)组成，是水稻既存的抗病性。

在潜伏早期，物理屏障和化学屏障能在一定程度上阻止病原菌的侵入或扩增，且二者往往同时发挥作用[70]。水稻物理屏障主要由气孔、细胞壁角质层及蜡质层等组成[71]。气孔等入侵通道是Xoo进入植株体内重要的理化障碍，其数量的多寡也会影响品种的抗病性[5]。水稻气孔的口径为0.90 μm，水孔的大小约是气孔的2倍[72]。Xoo的大小为0.61 μm×1.79 μm，推测病原菌可能不通过气孔入侵水稻[73]。除了水孔外，叶片形态也会间接影响病原菌的扩散[74]。在抗病品种中，一般株型紧凑、叶片窄而挺直、开张角度小、叶片绒毛多[75]。相反，感病品种生长茂盛，且叶片平展，叶片相互摩擦几率大，利于病原菌的传播扩散[50]。生长素(IAA)和油菜素内脂(BR)均参与调控水稻叶片角度，BR参与水稻对Xoo的抗性[76-77]。有关BR能否通过调控叶片角度参与水稻白叶枯病菌的传播扩散有待进一步探索。水稻的化学屏障主要由酚类化合物或木质素等具有抗菌或抑菌活性的次生代谢物组成[50]。在抗病品种中，植株体内的多元酚和糖类均高于感病品种，而有利于病原菌生长的谷氨酸和天冬氨酸的含量则比较低[78]。

水稻的诱导性防御机制包括病原相关分子触发的免疫反应(PTI)和效应分子触发的免疫反应(ETI)，是水稻主要的先天性免疫防御系统[79]。PTI是一种由病原菌相关分子模型(PAMPs)所激发的一类具有广谱性、持久性和稳定性的抗病反应，是一种低水平、非特异性、基础性的免疫反应[80]。例如，OsFLS2属于LRR-RLK结构蛋白，OsFLS2识别病原菌的Flg22后，其胞内结构域可通过与OsRac1互作激活PTI。相对于PTI，ETI促发的免疫反应更为快速、剧烈、专一化，是水稻与病原菌在协同进化中获得的特异性免疫反应[81]。在病原菌侵染寄主后，由效应分子触发ETI的部位均表现为过敏性坏死(HR)，进而限制病原菌的扩散和传播[82]。ETI能使寄主产生SAR，也具有广谱抗性。例如，OsXa21是位于细胞膜上的抗病蛋白质，它能特异性识别Xoo分泌的RaxX蛋白，继而激活水稻免疫反应[15]。

6 展望

水稻与Xoo的互作十分复杂。病原菌入侵植株，不但会引起寄主细胞和病原菌细胞结构的变化，也会诱导水稻内源防御系统的变化。目前，综合防控水稻白叶枯病的方法包括：培育抗病品种、化学防治和生物防治等主要措施。水稻白叶枯病抗性基因具有多样性，其介导的抗病机制没有明确的交叉现象。因此，深入解析抗病基因和抗病相关基因的作用机理，对于抗病品种的布局、轮换以及多基因聚合育种具有重要的生产指导意义。

水稻与Xoo是一种敌我的协同进化关系，符合“基因-基因”假说。在植物病理学家的共同努力下，对水稻白叶枯病抗性基因的作用机理已经进行了深入而系统的研究。若从病原菌与寄主互作的角度出发，以下3个科学问题尚待明确：第一，Xoo哪些致病基因会被寄主诱导表达，与之对应的水稻诱导物是什么？第二，水稻哪些抗病性基因会被Xoo诱导表达，与之对应的无毒基因又分别是什么，它们的互作关系如何？第三，如何在水稻育种中统筹使用好抗病基因和抗病相关基因？因此，深入解析抗病基因与致病基因的互作分子机制，将为水稻白叶枯病的综合防控提供理论依据。