热应激通过钙信号调控湖羊卵巢颗粒细胞凋亡和雌激素合成

李 樊， 李隐侠， 舒嘉傲， 孟春花， 张 俊， 钱 勇， 曹少先

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京210014；2.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏南京210014；3.农业农村部种养结合重点实验室，江苏南京210014)

随着绵羊养殖集约化发展和全球变暖加剧，热应激对绵羊生产性能的不利影响日益严重。有研究结果表明，热应激组公羔羊的生长速度和饲料利用率均显著低于正常组的羔羊[1]；夏季公羔羊的生长速度、饲料利用率和腰肉产量均显著低于冬季[2]。在交配周期内，环境温度大于等于32 ℃的条件下每增加1 d，母羊的受精率和产羔率分别下降2.7%和3.5%[3-4]，说明交配期间的高温对受精、胚胎存活都产生不利影响。热应激影响绵羊卵母细胞后期的发育，且延长发情周期，导致受精率和胚胎成活率明显下降。

钙离子通过在细胞内外形成离子梯度，在细胞内充当第二信使。钙稳态是细胞信号转导的中心，受到许多离子通道、泵和交换器的严格调控[5]。在非兴奋性细胞中，大多数细胞内钙离子的释放是通过以下3种通道进行的：(1)内质网膜上的1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3Rs)的钙离子通道；(2)内质网中的RYR(Ryanodine)受体的钙释放通道；(3)溶酶体样细胞器中的烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAADP)钙离子通道[6]。

控制钙离子释放或者积累的钙信号通路在调控细胞周期、生长、发育和繁殖等方面发挥重要作用。钙离子浓度在细胞分裂间期(DNA合成前期/DNA复制期、DNA合成后期/细胞分裂期)和细胞分裂中期到后期的相变期间显著增加[7-9]。在斑马鱼和非洲爪蟾胚胎发育过程中都有观察到细胞间的钙波存在[10-11]，在哺乳动物卵子激活和胚胎发育中也发现了钙信号的重要作用[12]。

本研究拟以湖羊卵巢颗粒细胞为对象，研究热应激对细胞钙离子浓度、钙离子通路相关基因表达、细胞凋亡和雌激素合成的影响，以期为解析热应激影响绵羊繁殖性能的分子机制提供理论依据，为缓解夏季绵羊热应激提供候选靶点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜的湖羊卵巢从江苏省太仓市东林屠宰场采集，放入装有37 ℃生理盐水的保温杯中立即带回实验室。生理盐水冲洗3遍后用手术剪剪掉卵巢周围组织，注射器抽取3～5 mm卵泡的卵泡液后轻轻注入15 ml的离心管中，1 000 r/min离心5 min，再用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗2遍后弃去PBS；用预热的DMEM/F-12培养基重悬细胞并将细胞接种于细胞培养6孔板中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中；24 h后观察细胞贴壁情况，用PBS清洗细胞，更换培养基，进行后续试验。

1.2 试验处理

湖羊卵巢颗粒细胞培养24 h，贴壁后分为3组，对照组(37 ℃)、热应激组(42 ℃)和热应激+钙离子螯合剂(BAPTA-AM)组(42 ℃)，分别在5% CO2细胞培养箱中培养4 h后收集细胞，进行RNA和蛋白质提取，每项试验进行3个生物学重复。

1.3 RNA提取和逆转录

用RNA提取试剂盒(BioTeke公司产品)抽提RNA，Nandrop2000分光光度计[赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品]测定RNA质量浓度。采用逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品)将RNA逆转录为cDNA；20 μl反应体系为：RNA 1 000 ng，4×gDNA wiper Mix 4 μl，RNase Free dH2O 16 μl，混合均匀，42 ℃ 2 min去除基因组DNA，然后加入5×HiScript II qRT SuperMix II 4 μl，吹打混匀， 50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反转录后所得的cDNA产物可于-20 ℃或-80 ℃保存备用。

1.4 引物合成和real-time PCR

根据绵羊相关基因的NCBI序列，采用Primer 5.0软件设计特异性引物，以β-actin为内参基因，进行real-time PCR试验(表1)。20.0 μl反应体系：2.0 μl cDNA，10.0 μl 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix (南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品)，0.4 μl上游引物，0.4 μl下游引物，7.2 μl ddH2O。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每个样本重复3次。

表1 real-time PCR引物序列

1.5 Western blot分析

将卵巢颗粒细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到80%时，将培养板分别置于37 ℃、42 ℃和42 ℃+BAPTA-AM条件下培养4 h，收集细胞蛋白质样品，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白质质量浓度，100 ℃ 10 min变性。处理好的蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，上样量为30 μg，60 V电泳3.0 h，然后进行转膜(100 V，30 min)，将膜置于5%脱脂牛奶中封闭1.5 h，用GAPDH蛋白(Proteintech公司产品，货号 60004-1-lg，稀释倍数1∶3 000)、BAX蛋白(Proteintech公司产品，货号 50599-2-lg，稀释倍数1∶2 000)、BCL2蛋白(Proteintech公司产品，货号 66799-1-lg，稀释倍数1∶2 000)、MFN2蛋白(AFFINITY公司产品，货号 DF8106，稀释倍数1∶2 000)、FIS1蛋白(AFFINITY公司产品，货号 DF12005，稀释倍数1∶1 000)、CYP19A1蛋白(AFFINITY公司产品，货号 DF6884，稀释倍数1∶1 000)抗体4 ℃敷育过夜，含吐温20的Tris盐酸(TBST)缓冲液洗膜(1次10 min，3次)，二抗室温敷育2 h，洗膜，显影，image J灰度值分析。

1.6 钙离子浓度测定方法

去除颗粒细胞的培养液，用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)缓冲液清洗3遍，每孔加入200 μl Fluo-4 AM(Fluo-4是钙离子荧光探针，AM是一种乙酰甲酯衍生物)工作液(终浓度为1 μmol/L)，37 ℃孵育30 min，随后用HBSS洗涤3次，洗涤后再孵育30 min以确保Fluo-4 AM在细胞内完全转变成Fluo-4。荧光显微镜检测荧光并拍照分析，以确定细胞内钙离子浓度的变化。

1.7 流式细胞术检测卵巢颗粒细胞的细胞凋亡率

湖羊卵巢颗粒细胞在各处理下培养48 h后，胰酶[不含乙二胺四乙酸(EDTA)]消化5 min，冷PBS缓冲液清洗2次， 100 μl 1×binding buffer 重悬，加入5 μl FITC Annexin V 和5 μl PI染色液混匀，避光孵15 min，加400 μl 1×binding buffer混匀, 染色后的样品于1 h内在流式细胞仪中进行细胞凋亡水平的检测，结果用FlowJo V7.6 软件进行分析。

1.8 数据分析

采用SPSS16.0 软件中t检验以及单因素方差分析进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 热应激对湖羊卵巢颗粒细胞钙离子浓度的影响

利用Fluo-4钙离子荧光探针检测热应激前后湖羊卵巢颗粒细胞中钙离子浓度的变化。结果(图1)显示，与对照组相比，热应激组湖羊卵巢颗粒细胞的钙离子荧光强度明显增强，说明热应激诱导卵巢颗粒细胞钙离子浓度升高。加入BAPTA-AM后，热应激组的钙离子浓度明显下调。

图1 热应激对湖羊卵巢颗粒细胞钙离子浓度的影响

2.2 热应激对湖羊卵巢颗粒细胞中钙离子信号通路相关基因表达的影响

钙离子是细胞的第二信使，热应激导致卵巢颗粒细胞钙离子浓度上升，可引起细胞膜的去极化。以钙离子信号通路中细胞膜去极化通路中CACNA1C、CACNA1B、RYR1和CAMK2共4个基因为对象，real-time PCR检测热应激对这4个基因mRNA表达的影响。结果(图2)表明，热应激组湖羊卵巢颗粒细胞中钙离子信号通路中CACNA1B、CACNA1C、RYR1、CAMK2基因表达均显著或极显著上调，但是热应激+钙离子螯合剂组，CAMK2基因表达显著下调(P<0.05)。

*表示差异达0.05显著水平；**表示差异达0.01显著水平。

2.3 热应激通过钙信号调控湖羊卵巢颗粒细胞线粒体结构相关蛋白质表达

以线粒体融合蛋白2(MFN2)和分裂蛋白(FIS1)为对象，检测热应激后其在卵巢颗粒细胞中表达水平的变化。Real-time PCR(图3)和Western blot结果(图4)显示，与对照组相比，热应激组线粒体融合蛋白基因MFN2无论是mRNA表达水平还是蛋白质表达水平均无显著变化，但是热应激组线粒体分裂蛋白基因FIS1的mRNA、蛋白质表达水平均显著提高。热应激+钙离子螯合剂组，FIS1基因的mRNA、蛋白质表达水平均较热应激组显著下调。

*表示差异达0.05显著水平；**表示差异达0.01显著水平。

*表示差异达0.05显著水平；**表示差异达0.01显著水平。

2.4 热应激通过钙信号调控湖羊卵巢颗粒细胞凋亡

流式细胞仪检测结果(图5)显示，与对照组相比，热应激组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，热应激+钙离子螯合剂组细胞凋亡率下降。与对照组相比，热应激组促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白家族代表基因BCL2在卵巢颗粒细胞中mRNA表达量的比值(BAX/BCL2)显著上升，但是加入钙离子螯合剂后比值下降。Western blot结果表明，热应激组BAX蛋白表达量上升，BCL2蛋白表达量下降，加入钙离子螯合剂后结果相反。说明热应激通过钙离子信号调控BAX基因表达上调和BCL2基因表达下调，调控湖羊卵巢颗粒细胞的凋亡。

A～C：流式细胞仪检测对照组(37 ℃)、热应激组(42 ℃)、热应激+钙离子螯合剂组湖羊卵巢颗粒细胞凋亡情况；D：流式细胞仪检测不同处理卵巢颗粒细胞凋亡率；E～F：热应激对颗粒细胞BCL2、BAX蛋白表达水平的影响；G：热应激对颗粒细胞促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白代表基因BCL2 mRNA表达量比值(BAX/BCL2)的影响。*表示差异达0.05显著水平。Annexin V：钙离子依赖性磷脂结合蛋白。

2.5 热应激通过钙信号调控湖羊卵巢颗粒细胞功能

为了研究热应激对湖羊卵巢颗粒细胞功能的影响，本研究用ELISA方法检测热应激后卵巢颗粒细胞雌二醇的水平。图6显示，与对照组相比，热应激组雌二醇含量显著下降(P<0.05)；热应激+钙离子螯合剂组与热应激组相比，雌二醇含量显著上升(P<0.05)。与对照组相比，雌激素合成关键基因CYP19A1的mRNA表达水平和蛋白质表达水平在热应激组卵巢颗粒细胞中均显著下降(P<0.05)，但是热应激+钙离子螯合剂组与热应激组相比显著上升(P<0.05)。说明热应激通过钙离子浓度调控湖羊卵巢颗粒细胞雌二醇合成能力，影响卵巢颗粒细胞的功能。

A～B：热应激对卵巢颗粒细胞CYP19A1 mRNA、蛋白质表达水平的影响；C：热应激对卵巢颗粒细胞雌二醇水平的影响;*表示差异达0.05显著水平。

3 讨论

热应激对动物健康有重要影响，可显著降低生产力和繁殖性能[13-14]。大量研究结果表明，很多基因和信号通路参与了热应激调控动物生产性能的过程，钙信号通路就是其中之一[15-17]。有研究发现，Ca2+-CaMK2-HSF1信号通路调控斑马鱼的热应激[17]。本研究以湖羊卵巢颗粒细胞为对象，发现热应激处理后，卵巢颗粒细胞中钙离子浓度显著上升，说明热应激导致卵巢颗粒细胞钙离子浓度发生变化，破坏细胞内的钙平衡。

热应激是如何调控卵巢颗粒细胞钙离子浓度变化的呢？钙离子通过其进入通道和释放通道进出细胞膜和细胞器，以满足机体各项生理功能的需要[5]。电压门控钙离子通道是一种钙进入通道，镶嵌于细胞膜上，其中央是高度选择性的亲水通道，允许适当电荷和适当大小的钙离子通过[18]。本研究发现热应激后电压门控钙离子通道基因CACNA1C、CACNA1B的mRNA表达水平显著上升，说明热应激打开了细胞膜上的钙进入通道。RYR1是内质网钙离子释放通道的一个关键受体[19]，是内质网钙池的钙离子进入细胞浆的重要通道之一。热应激后湖羊卵巢颗粒细胞中RYR1表达量显著上升，说明热应激引起卵巢颗粒细胞中内质网应激，内质网中的钙离子通过RYR1受体进入细胞质。总之，热应激打开卵巢颗粒细胞钙离子进入通道和释放通道，导致细胞外钙离子进入细胞质，内质网中的钙离子释放到细胞质，导致细胞质内钙离子浓度上调。

释放到细胞质中的Ca2+很快与Ca2+结合蛋白相结合，成为信号转导途径的激活成分，钙调素就是其中之一。钙调蛋白是一种依赖于钙离子活性的蛋白质，与钙离子结合形成Ca2+/CaM复合物，从而启动下游多种信号通路[20]。热应激导致卵巢颗粒细胞钙/钙调素依赖性蛋白激酶(CAMK2)表达量显著升高，但是在热应激卵巢颗粒细胞中加入钙离子螯合剂后，CAMK2基因表达量显著下调，说明热应激导致卵巢颗粒细胞钙离子浓度上升，诱导CAMK2表达上调，进而启动下游其他信号通路，参与调控细胞的功能。

线粒体为细胞正常生长代谢提供必需的能量，线粒体稳态对维持机体的生物学功能具有非常重要的作用[21-23]。融合和分裂伴随着线粒体的一生，维持着线粒体的稳态[24]。有研究发现，氧化应激会损伤线粒体，破坏线粒体稳态[25]。本研究选择调控线粒体融合和分裂的2种蛋白质MFN2、FIS1，探讨热应激导致钙离子浓度变化后对MFN2、FIS1表达的影响。结果发现在湖羊卵巢颗粒细胞中，热应激导致线粒体分裂基因FIS1表达量显著升高，降低细胞内钙离子浓度后FIS1基因表达水平恢复正常，说明热应激可能通过调控钙离子浓度来调控线粒体分裂基因FIS1的变化，进而诱导线粒体损伤。

BAX作为促凋亡蛋白参与细胞凋亡，而BCL2蛋白可拮抗BAX的促凋亡效应，BAX/BCL2失衡导致半胱天冬酶释放并引发半胱天冬酶级联发生，最终激活半胱天冬酶3导致细胞凋亡[26-27]。本研究发现，热应激后绵羊卵巢颗粒细胞的细胞凋亡率显著上升，促凋亡蛋白基因BAX和抗凋亡蛋白基因BCL2的表达量比值显著上升；加入钙离子螯合剂后，BAX/BCL2表达量比值显著下降，细胞凋亡率下降，表明热应激通过调控钙离子浓度的变化，引起BAX/BCL2表达量比值变化，进而诱导卵巢颗粒细胞凋亡。

卵巢颗粒细胞是雌性动物卵巢卵泡的重要组成部分，颗粒细胞分泌雌二醇，促进卵泡的生长发育和卵母细胞的成熟，进而调控雌雄动物的生殖[28]。本研究发现，热应激后调控雌激素合成关键基因CYP19A1的mRNA、蛋白质表达水平均显著下降，但是加入钙离子螯合剂后CYP19A1的mRNA、蛋白质表达水平显著上升；相应的，热应激后湖羊卵泡颗粒细胞分泌雌二醇的能力显著下降，钙离子螯合剂加入后能恢复由于热应激导致的雌二醇下降。说明热应激通过钙离子信号调控卵巢颗粒细胞凋亡，从而影响其细胞功能，进而影响动物的繁殖。

4 结论

热应激导致卵巢颗粒细胞细胞膜上的钙离子进入通道(电压门控钙离子通道)和钙离子释放通道(RYR1受体)打开，钙离子浓度上升，导致CAMK2蛋白表达上调，激活下游信号通路，诱导细胞凋亡，进而影响卵巢颗粒细胞的功能，调控绵羊的繁殖性能。