基于免疫相关细胞因子研究理冲汤对子宫肌瘤细胞凋亡和增殖的影响

李冬华 刘 宇 王文娜

(首都医科大学中医药学院，北京，100069)

子宫肌瘤(Uterine Fibroid)是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，育龄人群发病率高达70%[1-2]。因其可导致月经量增多、痛经甚至不孕等问题，严重影响女性的身心健康[3-4]，故一直备受学界重视。目前子宫肌瘤的病因尚不完全明确。子宫肌瘤不仅病程较长，而且会伴随诸多的临床症状。对于体积较大的肌瘤，临床上通常采用子宫切除术的终极治疗手段，但对于要求保留子宫的肌瘤患者来说这样的手术方法往往难以接受。虽然有肌瘤剔除术可供选择，但其存在较高的术后复发风险[5]，也不是理想的解决方案。现代医学主要使用激素类药物，如促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing Hormone，GnRH)激动剂、米非司酮等，虽然临床疗效明确，但严重的不良反应及潜在的致癌风险限制了其长期使用，而且还存在着停药后极易复发等问题[6-7]。目前子宫肌瘤尚缺少理想的治疗药物，因此临床上仍存在部分患者的治疗需求无法得到满足的问题。

理冲汤是治疗子宫肌瘤的中医经典名方，大量临床实践证实该方可明显缩小肌瘤体积，显著改善临床症状，对子宫肌瘤具有较为理想的疗效。前期研究表明理冲汤可抑制肿瘤新生血管生成、阻碍细胞外基质降解以及抑制肿瘤免疫逃逸[8-10]，提示理冲汤对子宫肌瘤微环境具有改善作用。但是理冲汤调控免疫应答抗子宫肌瘤的作用机制还不是十分清楚，目前仍存留着诸多科学问题值得被人们深入研究。因此，本研究通过透射电子显微镜观察细胞超微结构，采用免疫组织化学染色检测胱天蛋白酶-3、Ki67的表达情况，以及使用MSD电化学发光技术检测白细胞介素-12p70(Interleukin-12p70，IL-12p70)、IL-1β、IL-6、生长相关癌基因/角质形成细胞趋化蛋白(Growth-related Oncogene/Keratinocyte Chemoattractant，GRO/KC)的表达水平，研究理冲汤调控免疫相关细胞因子，促进子宫肌瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用机制，为理冲汤的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 CB-17 Scid小鼠[北京维通利华实验动物科技有限公司，SCXK(京)2016-0001]，雌性，未孕，6～9周龄，共24只，饲养于首都医科大学实验动物部，温度为25～27 ℃，恒湿为45%～50%，饲养环境为无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级。本研究通过伦理委员会审批(伦理审批号：AEEI-2017-115)。

1.1.2 药物 理冲汤的药物组成为生黄芪9 g、党参6 g、白术6 g、生山药15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪术9 g、生鸡内金9 g，上述药物均购自北京同仁堂饮片有限责任公司。制备工艺如下，饮片水提2次，煎煮1 h/次，首次加入饮片的8倍量水，第2次加6倍量水，煎成之时，加少许好醋。合并2次煎液，温度为60 ℃，压力为0.05 kPa的条件下过滤减压，浓缩至浸膏(相对密度为1.3)。最终配置成含生药1.7 g/mL的浓缩液，-4 ℃低温保存。

米非司酮(北京紫竹药业有限公司，批号：43110911)，用0.5%羧甲基纤维素钠(Sigma公司，美国，批号：C5678)配制成悬液，浓度为0.7 mg/mL。黄体酮注射液(上海通用公司，批号：130905)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸公司，批号：0703121)；碱性成纤维细胞生长因子(Signalway Antibody公司，美国，批号：70402)；表皮生长因子(Signalway Antibody公司，美国，批号：70504)。

1.1.3 试剂与仪器 MSD试剂盒(上海优宁维生物科技股份有限公司，批号：K15048D-1)；光学显微镜(Olympus公司，日本，型号：CX31)；MSD超敏因子电化学发光分析仪(MSD公司，美国，型号：Quick-Plex SQ120)。

1.2 方法

1.2.1 分组和异种移植小鼠子宫肌瘤模型的建立 将24只小鼠采用随机数字法分为正常组、模型组、理冲汤组和阳性药组，每组6只。人子宫肌瘤样本来源于首都医科大学附属北京妇产医院因患子宫肌瘤行全子宫切除术者，确保患者至少在术前3个月未接受过其他药物治疗，实验样本通过组织病理学证实。取子宫肌瘤组织1 cm3左右，迅速置于磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)(含3%青链霉素)中，封闭冰浴转移至细胞间。把组织块尽可能切成糜状，Ⅰ型胶原酶消化约2 h，使用70 μm细胞筛收集细胞。细胞在20%胎牛血清培养液中培养，传至2～3代时将细胞浓度调整为1.5×106个/mL用于细胞异种移植手术。除正常组外，其他小鼠腹腔注射雌、孕激素7 d以促进子宫发育。使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，剖腹探查术剥离Y形子宫，在子宫左侧分角处注入表皮生长因子(0.5 ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(2 ng/mL)。注射器吸取100 μL子宫肌瘤细胞悬液，并与伊文思蓝混合(使注射位点可视化)后注入小鼠子宫右侧分角处，操作结束后逐层缝合腹膜切口。28 d后各组选取1只小鼠进行子宫病理学鉴定，当平滑肌有明显紊乱或增厚，视为模型制备成功。

1.2.2 药物干预 理冲汤组每日灌服理冲汤浓缩液(30 g/kg)。阳性药组每日灌服米非司酮悬液(2.9 mg/kg)。正常组和模型组每日灌以等量的0.9%氯化钠溶液。连续药物干预28 d。

1.2.3 检测方法 透射电子显微镜：切取子宫组织1 mm3，戊二醛固定液固定24 h。PBS冲洗3次，加入1%锇酸，静置处理1 h。4 ℃环境下进行乙醇梯度脱水3次，之后按1∶1比例配制90%乙醇和90%丙酮混合溶液再次脱水，最后于室温环境下100%丙酮中脱水。将组织样品逐梯度渗透，使包埋剂浸入组织细胞内，之后烘箱进行固化。采用超薄切片机将组织块切片，切片面积控制在0.5 mm×0.3 mm之内，厚度为10～100 μm。柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色后，切片移至电镜下进行观察。

免疫组织化学染色：使用多聚甲醛固定子宫肌瘤组织，常规浸蜡、包埋，切成厚度约为5 μm的组织切片。切片常规脱蜡后进行抗原修复，再浸泡在3% H2O2溶液中，室温避光25 min。10%正常兔血清封闭后，加入一抗，湿盒内4 ℃孵育过夜。次日加入二抗室温孵育50 min。DAB显色和细胞核复染，中性树胶封片。镜下观察拍照，ImageJ软件对图片进行统计处理。

MSD电化学发光技术：将配置完成的标准品复溶室温平衡15 min，涡旋震荡，标准品原液4倍稀释，样本和质控品稀释2倍。用200 μL洗涤液反复清洗MSD板3次，每孔加入50 μL样品，室温下孵育2 h，每孔中25 μL检测抗体，室温孵育2 h，之后加入150 μL的读板液，使用MSD设备读板分析。

2 结果

2.1 采用透射电镜观察子宫平滑肌细胞的超微结构 正常组的子宫平滑肌细胞呈长梭形，排列整齐，相邻细胞体积一致，细胞膜结构完整。细胞核明显，核仁位于中央，无肿大或固缩。胞质内各细胞器数量、结构均正常；模型组的子宫平滑肌细胞肥大，细胞间隙增宽，排列不规则，细胞周围存在大量纤维结缔组织。细胞膜增厚、缺损，界限不清。细胞核有明显皱缩，核仁模糊不清甚至消失。细胞器均有不同程度的肿大变形，可见线粒体基质变浅，嵴变短，粗面内质网扩张，内部形成空泡；理冲汤组的子宫平滑肌细胞形态正常，排列有序，细胞膜结构完整，仅有少量胞膜增厚。细胞核清晰，呈轻度固缩，核仁无异常。线粒体与粗面内质网数量较模型组明显减少，部分轻微肿大；阳性药组的子宫平滑肌细胞排列紊乱程度较模型组显著减轻，但细胞间隙宽窄不等，其间可见少量纤维结缔组织。细胞膜大体完整，个别部位有破损，胞膜增厚不明显。细胞核结构清晰，核膜完整，核仁位于中央，略有皱缩。少量发达的线粒体围绕于胞核周围，粗面内质网肿胀不明显。见图1。

图1 子宫平滑肌细胞的超微结构(×8 000)

2.2 采用免疫组织化学染色检测胱天蛋白酶-3、Ki67的表达情况 与正常组比较，模型组胱天蛋白酶-3表达明显降低，Ki67的阳性率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，理冲汤组和阳性药组的胱天蛋白酶-3的表达明显升高，Ki67的阳性率明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 子宫组织中胱天蛋白酶-3、Ki67表达情况

胱天蛋白酶-3主要表达于细胞质中，表达胱天蛋白酶-3的细胞被染成棕黄色。Ki67主要表达于细胞核中，表达Ki67的细胞核被染成红色。由此可看出较之于正常组，模型组中的平滑肌细胞和腺体细胞中Ki67的表达较为丰富，胱天蛋白酶-3的表达较少，而理冲汤组和阳性药组中Ki67的表达较少，但胱天蛋白酶-3的表达增多。见图2、3。

图2 4组胱天蛋白酶-3的表达情况(免疫组织化学染色，×200)

图3 4组Ki67的表达情况(免疫组织化学染色，×200)

2.3 4组IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC的表达情况 与正常组比较，模型组IL-12p70的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，理冲汤组IL-12p70的表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，阳性药组IL-12p70表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

与正常组比较，模型组IL-1β、IL-6、GRO/KC的表达水平明显升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，理冲汤组的IL-1β、IL-6、GRO/KC的表达明显降低(P<0.05，P<0.01)，阳性药组仅IL-6表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，IL-1β、GRO/KC变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 子宫组织中IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC表达情况

3 讨论

肿瘤的发病和人体自身免疫应答异常有着非常紧密的关系。现代免疫编辑理论认为，肿瘤的发生发展在患者体内要经历3个阶段：清除、平衡、逃逸[11]。早期新生肿瘤细胞具有较强的抗原性，易被免疫系统识别并清除。如果此时肿瘤细胞逃脱免疫系统的“清除”功能，即会进入“平衡”状态，此阶段肿瘤细胞的抗原性减弱，不易被免疫系统识别和清除。当这种“积累效应”达到一定程度时，就会打破平衡，最终实现免疫逃逸，形成实体肿瘤[12]。肿瘤发生的实质即是机体抗肿瘤免疫系统逐渐步入劣势，肿瘤细胞逐渐趋于强势的过程。

在子宫肌瘤形成的过程中，免疫微环境内的不同细胞因子发挥了不同作用。IL-12p70是抗肿瘤免疫应答反应中的重要细胞因子。目前有研究证实，IL-12p70可以增强CD8+T淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞对肿瘤的杀伤作用[13]。同时，IL-12p70还可以诱导免疫淋巴细胞产生γ干扰素，进而改变肿瘤细胞增殖周期，促进肿瘤细胞发生凋亡[14]。IL-1β与肿瘤的增殖、分化及侵袭过程密切相关。IL-1β在产生生物活性前，需要经过胱天蛋白酶-1的剪切加工，IL-1β成为成熟体后可以介导血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor，VEGF)的生成，进而诱导肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤生长[15]。IL-6主要通过JAK激酶2(Janus Kinase 2，JAK2)以及信号转导及转录激活因子3(Signal Transduction and Activator of Transcription 3，STAT3)信号通路促进局部炎症反应的发生，诱导肿瘤细胞的增殖和侵袭。肿瘤细胞同样通过STAT3信号通路促进IL-6的分泌[16]。肿瘤生长相关基因(Growth Related Oncogene)GRO/KC是ELR-CXC趋化因子家族中的一员，GRO与受体CXCR2结合可诱发多种生理效应，如炎症反应、病毒感染等[17]。近年来发现，GRO在肺癌、胃癌、膀胱癌等癌症中呈高表达状态，后续研究也证实GRO与肿瘤的增殖、侵袭等过程具有一定相关性[18]。胱天蛋白酶-3是细胞凋亡通路下游的关键蛋白，其表达水平反映了细胞的凋亡程度。通常胱天蛋白酶-3在细胞质中处于无活性状态，凋亡程序启动时胱天蛋白酶-3被激活，并对局部结构蛋白进行切割，最终引起细胞凋亡[19]。抑制细胞增殖因子Ki67分布于细胞核内，其活性与细胞增殖过程密切相关，是衡量细胞增殖水平的标志物，也是评估肿瘤预后的重要指标[20]。

理冲汤是治疗正虚血瘀型子宫肌瘤的中医经典名方，出自张锡纯所著医书《医学衷中参西录》，用来治疗“妇女闭经不行或产后恶露不尽，……治一切脏腑癥瘕、积聚、气郁、脾弱、满闷、痞胀、不能饮食”。该方具有扶正祛瘀之功效，为消补兼施的良方。方中黄芪与党参为君药，用以扶正祛邪、益气活血，使瘀血去，新血生；三棱与莪术为臣药，以活血祛瘀；白术、山药、知母、天花粉共为佐药，其中白术、山药补气健脾，助参芪扶正，防化瘀太过伤气，知母、天花粉凉润解毒，可制参芪之热，又可滋肾水之枯；生鸡内金为使药，消积散结而不伤正。理冲汤配伍严谨，用药精当，攻补兼施，体现了扶正祛邪兼顾，消癥瘕而不伤正，益气血而不留瘀的特点。因此，理冲汤被广泛应用于治疗正虚血瘀之妇科癥瘕，十分契合子宫肌瘤的中医病机。

本研究结果显示，理冲汤能够改善子宫组织的细胞超微结构，促进细胞凋亡因子胱天蛋白酶-3的表达，抑制细胞增殖因子Ki67的表达，同时促进IL-12p70，抑制IL-1β、IL-6、GRO/KC的表达，说明理中汤可以通过调控免疫相关细胞因子的表达水平进而促进子宫肌瘤细胞凋亡、抑制其细胞增殖，达到抑制子宫肌瘤的目的。

中医药治疗子宫肌瘤具有突出优势，但基础研究较为薄弱，存在着物质基础及药理作用机制不明确等问题，一定程度上阻碍了中医药进一步迈向科学化和国际化的进程。本研究阐释了理冲汤在免疫调控方面的部分作用机制，旨在为理冲汤的临床应用提供理论依据，为中医药事业的发展做出积极贡献。