不同加工方法对金银花茶质量的影响

刘倩，卢恒，王晓，刘伟，刘峰，耿岩玲

（齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省分析测试中心，山东 济南 250014）

金银花（Lonicera Japonica Thunb.）为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初放的花，主要分布在我国山东、河南、湖南、湖北、广东、广西等地，其中山东、河南为主要栽培区[1]。金银花始载于李时珍的《本草纲目》，并在2002年被卫生部新增为药食同源植物，其主要有效成分有绿原酸、黄酮和挥发油等，具有抗癌、抗菌、清热解毒、凉血止痢、疏散风热之功效，其中绿原酸和异绿原酸具有广谱抗菌、抗氧化的作用；黄酮类化合物如木犀草苷等具有消炎、改善心血管功能以及抗癌作用；挥发油具有抑菌、抗病毒的作用[2-4]。金银花作为一种药食同源的传统中药材，具有较高药用价值和保健功能，多用于治疗风热感冒、痈肿疔疮、热毒血痢等症，除被大量应用于临床治疗以外，目前在食品领域也被广泛使用，如新鲜的金银花和加工后的金银花干品均可作为饮用茶[5-6]。

随着社会经济的不断发展，茶类饮品在我国各类饮品中比例逐渐提高，同时，人们对于各种茶类饮品在口感和疗效上的诉求也不断提高，而在制茶加工过程中，不同的工艺参数会对产品品质造成一定的影响[7-9]。近年来，作为一种日常保健饮品的代用茶，金银花茶的研究与开发也逐步引起人们的重视，但目前金银花茶的生产主要是将药用金银花通过初步筛选后，再包装或者复配而成，而关于金银花茶加工工艺的研究，仍处于初级阶段，尤其是制茶工艺与相关化学成分变化方面的研究鲜有报道。

本试验探究金银花茶的加工工艺，包括加工方法、时间、加工温度等，采用高效液相色谱法检测金银花的主要活性成分含量，如绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷、马钱苷、芦丁和槲皮素等，并进一步运用气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography ion mobility spectroscopy，GC-IMS） 法分析金银花中挥发性风味物质成分，结合感官评定结果，确定金银花茶的最优加工工艺，以期为金银花的开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters2695高效液相色谱系统（配有二极管阵列检测器）：美国Waters公司；气相离子迁移谱仪[配有分析软件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和3款插件以及GC×IMS Library Search]：济南海能仪器股份有限公司；BSA电子分析天平：德国赛多利斯公司；TYP10S超纯水机：济南太平玛环保设备有限公司；SB-5200D型高功率数控超声波仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；D238B1型东芝电烤箱：广东美的厨房电器制造有限公司；XUNTU-TH667935炒茶机：国匠食品机械厂；HF-881-2型热风循环干燥机：吴江华飞电热设备有限公司；FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 材料与试剂

试验所需样品为临沂市采摘的优质金银花，经山东中医药大学药学院李佳教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的花；绿原酸（批号：Y24J7K16726）、异绿原酸 C（批号：MUST-14111414）、木犀草苷（批号：MUST-15012204）、马钱苷（批号：R23D7F27552）、槲皮素（批号：C09S8Y43412）、芦丁（批号：Y22S6S3719）：上海源叶生物科技有限公司；异绿原酸A（批号：160309）：上海融禾医药科技有限公司；异绿原酸B（批号：14534-61-3）：宝鸡市辰光生物科技有限公司；乙腈、乙酸（色谱纯）：美国Tedia公司。其他试剂为分析纯。

1.3 金银花预处理

采集好的金银花样品，仔细挑选，清理杂质后冲洗干净，放置于托盘中摊晾。将金银花经过以下3种方式加工处理。

1）烘制加工：每次称取100 g金银花，放置于烘盘上，放入热风循环干燥机中，烘制温度分别设置为100、120℃，时间为3 h，得到样品1号、2号。

2）炒制加工：每次称取100 g金银花，放入炒锅内，调制功率分别为 110、220、330、440 W，炒至金银花变色为止，得到样品3号～6号。

3）烤制加工：每次称取100 g金银花，放入烤盘中，烤制温度分别设置为120、150、180℃，时间为20 min，得到样品7号～9号。

1.4 有效成分含量测定

1.4.1 供试品溶液的制备

将金银花样品1号～9号及金银花鲜样（10号样品）经自然放置干燥后，分别粉碎，过4号筛（60目）。精密称取金银花药材粉末0.2 g，加入甲醇溶液10 mL，水浴（40℃）提取10 min后加入纯水5 mL，超声（功率250 W，频率20 kHz）30 min复提，用70%甲醇水溶液补足减失的质量，提取液过0.22 μm有机滤膜，即得供试品溶液。

1.4.2 标准品溶液的制备

精密称取绿原酸、马钱苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、槲皮素对照品适量，加甲醇配制成浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液，其中木犀草苷（70%甲醇）配制为0.5 mg/mL的对照品溶液，均于4℃避光保存备用。

1.4.3 色谱条件

Waters2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC），Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，进样量：10 μL；检测波长：254 nm。流动相A为乙腈，流动相B为水（0.2%甲酸），梯度洗脱：0～10 min，8%～10%A；10 min～20 min，10%～15%A；20 min～30 min，15%～15%A；30 min～40 min，15%～25%A；40 min～50 min，25%～30%A，50 min～51 min，30%～100%A；51min～60min，100%～100%A；流速：1.0mL/min。

1.4.4 指纹图谱方法学考察

1.4.4.1 线性关系考察

将绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、马钱苷、芦丁、木犀草苷、槲皮素8种对照品溶液分别稀释，得到不同浓度的对照品混合溶液[10-13]，通过HPLC进行线性分析。

1.4.4.2 精密度试验

取样品1号，按1.4.1项下前处理方法制成供试品溶液，精密吸取供试样品溶液10 μL，连续重复进样6次，测得其中8个特征峰的峰面积和保留时间，分别计算其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4.4.3 稳定性试验

取样品1号，按照1.4.3项下的色谱条件，分别在0、3、6、9、15、24 h 进样分析，记录色谱图中特征峰的峰面积和保留时间，分别计算其相对标准偏差。

1.4.4.4 重复性试验

取样品1号，按1.4.1项下处理方法制成供试品溶液6份，按照1.4.3项下的色谱条件测定，测得8个特征峰的峰面积和保留时间，并计算RSD值。

1.4.4.5 样品的含量测定

分别取不同加工方法处理得到的10批金银花，采用1.4.1供试品溶液制备方法制备样品溶液，采用1.4.3色谱分析条件分别对绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、马钱苷、芦丁、木犀草苷、槲皮素进行HPLC-DAD测定，记录色谱峰面积，将面积带入回归方程，计算各成分含量。

1.5 离子迁移谱

1.5.1 供试样品预处理

称取1～10号金银花样品各1 g，置于20 mL顶空瓶中，80℃孵育15 min后进样。

1.5.2 离子迁移谱分析条件

色谱柱类型：FS-SE-54（15 m），内径：0.53 mm，分析时间25 min，柱温55℃，IMS温度50℃，载气/漂移气为N2。采用自动顶空进样，进样体积200 μL，孵育时间15 min，孵育温度80℃，进样针温度85℃，孵化转速500r/min。漂移气流速（E1）为 150 mL/min。气相载气流速（E2）为 0～2 min，2 mL/min；2 min～12 min，2 mL/min～50 mL/min；12 min～17 min，50 mL/min～100 mL/min；17 min～20min，100mL/min～150mL/min；20min～25 min，150 mL/min。

1.6 金银花茶感官品质评审方法

按照国家标准GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》，邀请13名（6男7女）经过相关专业训练的人员进行评审。精确称取各种加工方法的金银花茶样品2 g，加入沸水100 mL，冲泡5 min，分别对茶样的外形、汤色、香气、滋味和汤底5项因子进行打分，按照表1的评分标准，取13人评价结果的平均值，作为测定结果[14-16]。

表1 金银花茶感官评价评分细则Table 1 Sensory evaluation and scoring rules of Lonicera japonica tea

1.7 数据处理

经LAV和GC×IMS Library Search Software软件分析得出样品中VOCs的差异谱图，并建立匹配矩阵，利用NIST数据库和IMS数据库对物质定性分析[17-20]。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱方法学结果

2.1.1 线性关系结果

按照1.4.3项下的色谱条件进样分析，得到8种对照品的液相色谱图，见图1。以峰面积积分值（y）对质量浓度（x）进行回归计算，得到各化合物的回归方程、相关系数、线性范围见表2。

图1 金银花茶及8种对照品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Lonicera japonica tea and 8 reference substances

表2 标准品回归方程、相关系数和线性范围Table 2 Regression equations，correlation coefficients and linear range of samples

2.1.2 精密性结果

经过方法学试验结果分析表明，8个特征峰保留时间 RSD 值依次为 0.8%、0.8%、0.7%、0.6%、0.8%、0.4%、0.6%、0.9%，均小于1.0%，峰面积RSD值依次是2.8%、1.8%、3.8%、3.5%、3.9%，0.7%、1.9%、0.8%均小于5%，结果符合指纹图谱的技术要求，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性结果

经过方法学试验结果分析表明，8个特征峰保留时间RSD依次是0.9%、1.2%、1.5%、1.1%、0.8%、1.2%、1.6%、0.8%，峰面积RSD依次是3.2%、2.9%、3.3%、3.9%、4.3%、4.1%、1.8%、1.2%，均小于5%，表明样品溶液在室温条件下24 h内化学稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求。

2.1.4 重复性结果

10种不同加工方法金银花茶提取物的HPLC图见图2。

图2 10种不同加工方法金银花茶提取物的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of 10 different processing methods of extracts of Lonicera japonica tea

经过方法学试验结果分析表明，8个特征峰保留时间的 RSD分别为 0.9%、0.8%、1.0%、1.1%、1.1%、1.2%、0.8%、0.5%，峰面积RSD值分别为3.4%、4.2%、4.5%、0.9%、3.4%、2.9%、4.1%、1.8%，结果表明该方法重复性良好，综上所述该方法符合对分析方法可控、可操作及可重复的基本要求。

2.2 不同加工方法下金银花中化学成分的含量

计算出1.4.4.1中8种化合物的相应峰面积，同时根据1.4.4.1方法中回归方程计算出各化合物的含量，平行3次后，取平均值，结果见表3。

表3 不同加工方法金银花茶中化学成分含量比较Table 3 Comparison of chemical components in Lonicera japonica tea with different processing methodsμg/g

由表3可知，经过120℃烘制加工的金银花茶中的绿原酸、异绿原酸A、芦丁和木犀草苷的含量较高，均高于其他加工工艺，4号炒制条件下异绿原酸C的含量最高，9号烤制加工得到的金银花茶中的马钱苷、槲皮素和异绿原酸B的含量均高于其他加工工艺，由此可知，经过加工处理后的金银花中的有效成分含量明显增高。

2.3 不同加工方法下金银花中风味物质的GC-IMS谱图对比分析

图3是不同加工方法金银花茶特征风味二维GC-IMS谱图，可以直接比较样品组内风味物质的差异性。红色垂直线表示反应离子峰，其中两侧的每个点代表一种挥发性物质。点的颜色代表物质的浓度，白色表示含量较低，红色则表示含量较高，随着颜色加深表示含量逐渐增高；同时一种挥发性化合物可能产生一个或多个亮点，代表单体或二聚体和三聚体，这主要取决于挥发性化合物的浓度高低，整个谱图代表了样品中全部顶空成分。

图3 不同加工方法金银花茶特征风味二维GC-IMS谱图Fig.3 Two-dimensional GC-IMS images of characteristic flavor of Lonicera japonica tea with different processing methods

由图3可知，对比不同加工方法处理的金银花茶，具有相同保留时间和迁移时间的挥发性有机物，累积含量具有明显不同，图上这8个点可作为区分不同加工方法金银花茶的指纹图谱参照点。

2.4 不同加工方法金银花中风味物质的GC-IMS定性分析

挥发性化合物的定性分析见表4。

表4 挥发性化合物的定性分析Table 4 Qualitative analysis of volatile compounds

在GC-IMS中，根据气相色谱的保留时间和离子迁移时间，通过数据库在金银花中共定性出39种挥发性成分，包括12种酮类、10种醇类、7种醛类、3种烯烃类、2种烷烃类、2种吡嗪类、2种酯类和1种吡喃类。

2.5 不同加工方法金银花茶GC-IMS指纹图谱分析

为了更加全面地对比不同加工方法下的金银花中挥发性化合物组分的差异性，使用LAV软件的Galleryplot插件，选取10组样品，所得GC-IMS二维图谱中所有的待分析峰自动生成指纹图谱，结果如图4所示。

图4 不同加工方法下金银花茶中挥发性有机物的指纹图谱Fig.4 Fingerprint of volatile organic compounds in Lonicera japonica tea with different processing methods

图4中每一行代表一个样品中选取的全部样品的信号峰。通过不同区域ABC对比可以看出，加工过的金银花和生金银花样品中的挥发性物质有明显的区别，而不同加工方法的金银花样品的挥发性物质之间则有各自的特征峰区域，同时也有共同的区域。其中，A中的挥发性物质种类与B、C相差较大，是金银花鲜品中特有的挥发性成分，C中的挥发性物质为烘制工艺中产生含量较高的组分，而B中的挥发性物质则在炒制和烤制过程中产生浓度较高的组分，可以看出通过GC-IMS能够快速准确地区分出金银花鲜品，并初步区分出烘制、炒制和烤制的金银花茶。

2.6 不同加工方法的金银花茶的感官评价结果

感官评价包括差别性分析、偏好性分析和描述性分析，其中描述性分析是通过描述术语对样品的感官特征进行客观的评价，目前在食品感官品评中应用最为广泛，能够精确分析一系列不同产品感官之间的具体差异，从而最大程度上获得食品的风味信息，因此，可以应用于食品新产品开发、产品改进以及质量控制等多个方面。不同加工方法金银花茶的感官评价结果见表5。

表5 不同加工方法金银花茶的感官评价结果Table 5 Sensory evaluation results of Lonicera japonica tea with different processing methods

由表5可知，金银花茶综合评价总体情况较好，经过不同加工方法得到的金银花茶的滋味、汤色和香气均在80分以上，但是，其中低温炒制由于炒制时间过长，导致外形破碎；高温炒制由于温度过高不易控制颜色变化，从而导致外形较差，容易焦糊，而影响了最终得分。而合适的温度得到的金银花茶的综合评价都较好，同时金银花生茶在汤色和滋味上比加工过的金银花茶略差。

3 结论

本研究以3种制茶工艺得到的9种金银花样品和1种金银花生品为原料，建立了金银花茶的HPLC指纹图谱，比较了样品组之间8种标准物质含量的高低，发现在烘制120℃和烤制180℃条件下的金银花茶中绿原酸、黄酮以及环烯醚萜苷的含量较高；基于GCIMS的结果，分析了金银花鲜样和加工过的金银花茶中挥发性成分的差异性，通过结合指纹图谱中的特征成分，可以初步区分不同加工工艺得到的金银花茶；同时感官评价测定的结果显示金银花加工制茶受加工方法影响不大，而受加工温度影响较为明显，在120℃条件下烘制和烤制的金银花茶的感官评价的分值均较高。结合试验数据分析，最终确定在120℃条件下烘制得到的金银花茶具有较多的活性成分，同时兼顾较好的口感和外观。