线纹海马早期性腺发育的组织学形态分析

陈美玲，符宏高，吴锐琼，张雪萍，杨 滢，闫亚楠，岑 万，郑乐云，黄 镇

(1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117； 2.福建省水产研究所，福建 厦门 361006)

海马(Hippocampus)隶属于有颌总纲硬骨鱼纲海龙目海龙科[1]．由于独特的外观，其具有较高的观赏价值，一直受到人们的青睐．它也是珍稀的海洋药源动物，在中医药学中占有重要地位[2]．干海马不仅作为重要的药源在国内外进行贸易[3]，还是制备功能性食品的原料，具有较高的应用价值[4]．

目前国内最主要的海马养殖品种有三斑海马(Hippocampustrimaculatus)、膨腹海马(Hippocampusabdominalis)和线纹海马(Hippocampuserectus)等．线纹海马原产于美洲地区、加勒比海等海域，因其具有生长速度快、繁殖和抗病能力强等特点被引进国内养殖[5]．经过十几年的摸索，线纹海马的人工育苗技术已经成熟[6]．但是，线纹海马的生殖生物学还有诸多问题有待研究．Selman[7]探索了线纹海马卵巢的基本结构，秦耿[8]在成年线纹海马的性腺及生长发育方面进行了初步的研究，陈灵珍等[9]将线纹海马精巢和卵巢皆分为6个时期，而目前线纹海马的早期性腺发育还未见相关文献报道．

原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)是能够产生雄性或雌性生殖细胞的早期细胞．在胚胎发育早期，其不断增殖并迁移至生殖嵴，与生殖上皮一起形成原始性腺，之后性别发生分化，形成精巢和卵巢[10-11]．研究表明，鱼类的PGCs迁移至生殖嵴有3种方式：鲟鱼是由脏壁中胚层迁移至肠系膜，最终到达生殖嵴部位；青锵通过体节由体壁中胚层不断迁移至生殖嵴处；部分鱼类利用血液循环系统迁移至生殖嵴[12-13]，如真骨鱼类肝中和细鳞大马哈鱼胚肾小管中的性原细胞.

近年来，vasa、dazl、boule和dnd等效应基因已被广泛用作生殖细胞标记物，以进一步研究鱼类原始生殖细胞的起源和迁移[14]．其中，vasa标记后生动物生殖细胞的研究最深入．Duangkaew等[15]发现vasa不仅在条纹鳗鲶生殖细胞表达，而且在精子和卵黄素有很强的信号.Wu等[16]证明vasa在美洲鲥生殖细胞中特异性表达且对生殖细胞分裂必不可少．

因此本研究将以VASA抗体定位线纹海马早期生殖嵴，之后通过组织学切片的技术解析卵巢和精巢开始分化和成熟的时间．本实验结果不仅为海马性腺发育生物学和性别决定机制的研究提供理论基础，还将为线纹海马的养殖育种提供理论指导．

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的线纹海马取自福建省水产研究所．

1.2 性腺组织切片制备与观察

自线纹海马出生后，每隔1 d进行取样，每次取样5只海马．量取每只海马体长后，在体视镜下解剖，观察性腺发育情况．随后，整只海马置于质量分数4%的多聚甲醛(PFA)溶液中，4 ℃条件下固定24 h．固定完成后，将样品置于体积分数为30%、50%和70%的酒精中进行梯度脱水，之后实验样品可放在体积分数70%的酒精中保存于-20 ℃冰箱．包埋切片实验开展前，将样品从体积分数90%和100%的酒精中进行梯度脱水，充分脱水后的组织经二甲苯透明和石蜡包埋，制备成蜡块，之后进行石蜡切片，切片厚度为8 μm．

1.3 苏木精-伊红染色(H.E染色)

将石蜡组织切片进行苏木精-伊红染色，中性树脂封片．在显微镜下拍照，并用配套软件进行图片处理．

1.4 免疫荧光技术

将石蜡组织切片按文献的方法[13]进行免疫荧光实验，所用的抗体为线纹海马VASA蛋白的抗体(本实验室自制)，二抗为Alexa Flour 488(Thermo Fisher)．完成后的切片利用激光共聚焦显微镜扫描荧光信号．

2 结果

2.1 VASA抗体的荧光染色定位线纹海马生殖嵴

为了观察线纹海马的早期生殖嵴发育，使用VASA抗体对出生后的线纹海马进行免疫荧光染色．出生后的线纹海马体长为12 mm，经过横向切片，在体腔背部观察到生殖嵴的组织，并且呈现VASA抗体的染色阳性信号(图1a)．为进一步观察生殖嵴的形态特征，对切片进行H.E染色(图1b)，在切片中可见生殖嵴左右成对存在，PGCs被一层体细胞包围，并且比周围的体细胞大，细胞呈卵圆形或圆形，胞质较多，细胞核较大，但此时期还没有出现精巢和卵巢分化．

(a)线纹海马性腺(荧光图)；(b)线纹海马性腺(H.E染色)箭头所指为原始生殖细胞，方框圈出结构为生殖嵴；PGC：原始生殖细胞；PN：胰脏

2.2 线纹海马卵巢的发育和分化过程

为了追踪线纹海马卵巢的发育，对出生后不同体长的雌性线纹海马进行横切，通过H.E染色观察卵巢的发育．当线纹海马体长为17 mm时，原始性腺开始分化，由圆形变成梨形，在其内部边缘处出现卵巢腔(卵巢腔的出现标志着性腺开始向卵巢分化)，同时卵巢腔附近还有成簇的细胞群(图2a).

当线纹海马体长为20 mm时，在性腺中观察到初级卵母细胞(图2b)．该时期的卵巢为Ⅱ期卵巢，其中有不同时相的卵母细胞，以Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞为主．

当线纹海马体长为40 mm时，在体视镜下可以分离出卵巢组织并进行石蜡切片和染色，发现卵巢中存在成熟的卵母细胞，其核仁消失，胞质中的卵黄颗粒逐渐融合(图2c)．同时在卵巢组织外观上橙色卵粒清晰可见(图2d)，标志卵巢已经发育成熟．

(a)卵巢发育初期；(b)Ⅱ期卵巢；(c)Ⅴ期卵巢；(d)成熟卵巢 G：肠；KND：肾； M：肌肉组织； OC：卵巢腔；PO：初级卵母细胞；OV：卵巢；P：腹膜；SO：次级卵母细胞；标尺为50 μm

2.3 线纹海马精巢发育和分化过程

为了追踪线纹海马精巢的发育，对出生后不同体长的雄性线纹海马进行横切，通过对切片进行H.E染色观察精巢的发育．当线纹海马体长为22 mm时，在切片中可以观察到精小叶(图3a)．精小叶的出现标志着在这个时期原始性腺开始向精巢分化，因此该时期为精巢的发育初期．

当线纹海马体长为25 mm时，发育初期的精巢开始发育成为未成熟的精巢组织．从切片中可以看到，精巢外侧的体细胞数量开始增多，精母细胞聚集成团并在精小囊中生长发育(图3b)．

当线纹海马体长为45 mm时，雄性海马的育儿袋已经开始突起，精巢在形态外观上已经可以识别．通过对精巢的切片和H.E染色，可发现在精巢的白膜内侧的空腔中存在许多精子细胞和精子(图3c)．同时在体视显微镜下可观察到精巢，其形状呈柱状，表面覆有一层浆膜，内部则有乳白色物质(图3d)

(a)精巢发育初期；(b) Ⅲ期精巢；(c)Ⅴ期精巢；(d)成熟精巢 N：脊索；KDN：肾；G：肠；SG：精原细胞；SL：精小叶；SC：谢尔托立氏细胞；PS：初级精母细胞；TA：白膜；SP：精子；ST：精子细胞；T：精巢；标尺为50 μm

通过观察不同体长雌性和雄性的线纹海马的性腺发育情况，总结不同体长下线纹海马的性腺发育特征，如表1所示．

表1 线纹海马不同体长的性腺发育特征

3 讨论

前人对海马精巢和卵巢的形态特征已有所研究．左镇生等[18]对日本海马(Hippocampusmohnikei)的卵巢发育做了初步的探究，并且较详细地阐述了日本海马卵巢的形态特征；Selman等[7]对线纹海马的卵巢进行了探索，描述了线纹海马卵巢的基本结构，对卵巢进行了初步的发育学分析；秦耿[8]对美国线纹海马的性腺结构及生殖细胞的形成机制进行了研究； Novelli等[19]研究了吻海马(Hippocampusreidi)卵巢的形成时期，并且描述了卵巢中不同时相的卵母细胞的形态特征；除此之外，Piras等[20]运用透射电镜对长吻海马(Hippocampusguttulatus)的成熟精子进行超微结构观察．

生殖细胞方面的相关研究发现了许多有关生殖细胞的标记基因，其中包括vasa、dazl、boule和dnd[14]．VASA已被广泛应用于鱼类胚胎发生过程中PGCs迁移的种系标记，其中包括斑马鱼(Daniorerio)[21]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[22]、青鳉(Oryziaslatipes)[23]和美洲鲥(Alosasapidissima)[16]．本研究利用vasa在配子形成过程中仅在生殖细胞中表达的特点[24]，对PGCs进行定位，找到线纹海马生殖嵴的位置，从而确定其性腺发育的位置．

本研究从组织学上对线纹海马早期性腺发育规律进行了探索．结果表明，在线纹海马胚胎发育早期，原始生殖细胞与体细胞分离，随后迁移至生殖嵴中，形成原始性腺．原始性腺形成后，其周围的体细胞进入增长期，进行大量的增殖与生长，但没有明显的精巢和卵巢的分化特征．经过一段时间的生长发育，原始性腺将在组织解剖学和细胞学上发生变化，出现明显的精巢或卵巢的分化特征．

鱼类性腺发育的相关研究通常把卵巢腔的形成作为鱼类卵巢开始发育的标志，而把生精小管或精小叶的形成作为精巢开始发育的标志．本研究发现在线纹海马体长为17 mm时，原始性腺分化，出现卵巢腔，随后继续发育形成成熟的卵巢．但在同一时期的线纹海马中并没有发现向着精巢分化的明显特征．而在体长为22 mm的线纹海马中发现了精小叶，因此在线纹海马早期性腺发育的过程中，卵巢的发育早于精巢．据相关研究报道，在雌雄异体的硬骨鱼中，多数是雌性的性腺发育早于雄性，例如布氏罗非鱼(Tilapiabuttikoferi)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevisgunther)等[25-26]．

切片观察发现在线纹海马的卵巢中存在不同时相的卵母细胞，可见线纹海马的卵巢发育属于不同步成熟型．Novelli等[19]对吻海马的研究也有相同的发现，这一发现与海马一年多次产卵的习性相符．在雄性线纹海马的切片中发现了精小叶，由此可以确定线纹海马的精巢属于小叶型．随着线纹海马的生长发育，精巢内出现空腔，当精巢处于成熟阶段时，精子细胞和精子向空腔中心移动．

本实验对线纹海马早期性腺发育进行了初步探究，为线纹海马性腺发育的后续研究奠定了基础，并为海马苗种的繁育提供理论指导．