基于“微生物-肠-脑轴”探讨糖尿病认知功能障碍

谢金洙

云南中医药大学，云南 昆明 650500

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是现代流行性代谢综合征、心血管疾病和脑血管疾病的主要危险因素，它的共存状态，如氧化应激、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、炎症和糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)，是认知功能障碍(cognitive dysfunction，CD)的潜在发病因素[1]。CD是指由于各种原因诱发的认知功能损害，主要表现为学习、记忆、理解、执行等能力下降，可伴有不同程度的精神症状[2]。T2DM后期可并发糖尿病认知功能障碍(diabetes cognitive dysfunction，DCD)，其确切病理、生理机制尚不清楚，但研究表明，微生物群及其代谢物通过迷走神经(vagvagnerve，VN)连接中枢神经系统(central nervous system，CNS)和肠神经系统(enteral nervous system，ENS)，调节脑组织和脑血管系统中淀粉样蛋白β(amyloid β，Aβ)的清除，保护血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)完整性，减轻CNS中的IR，从而维持大脑和肠道的双向平衡，改善DCD。早期的干预治疗对DCD的改善有重要作用，有研究认为，肠脑串扰可能在这一过程中起关键作用，肠脑串扰是一个非常复杂的网络系统，它一方面维持胃肠道的稳定，另一方面影响情绪和认知功能，这个网络被称为“微生物-肠-脑轴(microbiota-gut-brain axis，MGBA)”[3]。迄今为止，在人体试验中可采用多样性组成成谱测序进行Alpha分析和Beta分析，对微生物群丰富度和均一度以及群落之间的相似度和差异度进行评估[4]。在动物实验中还涉及大脑中神经元、小胶质细胞、周细胞以及肠道上皮细胞的研究[5]。目前，在各种干预研究中，粪便微生物群移植(feces-based microbiome transplantation，FMT)、抗生素治疗、饮食和益生菌均被认为能有效治疗DCD，但具体效果及机制还有待探索。本文从MGBA角度探讨微生物群在肠脑中的串扰作用，为治疗DCD提供新思路。

1 微生物-肠-脑轴

肠道是一个复杂的生态系统，由微生物群、宿主细胞和营养物质组成。健康成人微生物群主要由厚壁菌门、变形杆菌门、拟杆菌门、放线杆菌门、梭杆菌门和疣状杆菌门组成。拟杆菌和厚壁菌在人体肠道中占据主导地位，在营养吸收系统和支持肠屏障增强中起着关键作用[6]。微生物群介导MGBA的一个重要机制在于其对肠道屏障的影响，主要包括细胞屏障和免疫屏障[7]。最近，MGBA在维持机体平衡中的作用得到重视，肠道和大脑通过MGBA进行相互交流，交流路径包括肝脏和胆囊代谢、免疫调节反应、神经支配、肠内分泌和微生物代谢信号[色氨酸代谢、短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)、支链氨基酸和肽聚糖等][8]。影响MGBA的因素包括遗传、出生时的分娩方式、饮食、环境、运动、药物和MG、压力、昼夜节律等。同时，MGBA影响宿主的行为，表现在食物摄取量、社会行为、认知功能、精神状态、压力应急等方面[9]。研究表明，MGBA与许多疾病有关，包括自闭症、抑郁症、焦虑症、厌食症、肥胖症、精神分裂症、多动症、强迫症、肠应激综合征、疼痛性疾病、癫痫、多发性硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病等[10-11]。因此，针对微生物群的调节，作为一种治疗各种神经精神疾病的新疗法被广泛研究[12]。

2 中枢神经系统和肠神经系统

自主神经系统(autonomous nervous system，ANS)由交感神经、副交感神经和ENS组成，共同调节宿主的生理稳态。ENS中约有1亿个神经元将肠道包围，其神经细胞数量仅次于CNS，它监管着整个消化道，能够独立运作胃肠道系统，同时，ENS可以通过迷走神经(vagus nerve，VN)、神经内分泌、神经免疫、ANS和微生物代谢物等与大脑保持沟通[13]。VN是第10条颅神经，是连接肠道和大脑最快、最直接的通路，它由80%的传入纤维和20%的传出纤维组成，从胃肠道、呼吸系统和心血管系统(自下而上)传递重要信息，并向内脏(自上而下)提供反馈[14]。ANS结合了ENS中微生物群的活性和CNS的调节，以及对内分泌、运动、自主行为的调控，从而负责维持宿主内稳态[15]。研究表明，颅脑损伤患者往往伴有胃肠道功能障碍，揭示了微生物群在维持肠道-大脑生态平衡中具有重要作用[16]。在肝郁脾虚证模型大鼠中，通过研究微生物群对肝郁脾虚证抗抑郁机制的CNS和ENS的相互影响，发现CNS与ENS可以通过微生物群相互影响，通过椎前神经节接收CNS的信息，调节交感神经和副交感神经的兴奋性，维持两者之间的平衡，恢复肠的正常运动和腺体分泌。虽然体外研究表明，特定的细菌能产生调节因子如5-羟色胺(5-hydrootonin，5-HT)和SCFAs[17]，但这些调节因子是否能够穿过BBB进入CNS内以及其特定靶点还未知[18]。

2.1 5-羟色胺5-HT是MGBA的关键调节因子之一，L-色氨酸(l-tryptophan，L-Trp)通过色氨酸羟化酶1(tryptophan hydroxylase 1，TPH1)对色氨酸进行酶降解，形成5-羟基-L-色氨酸，随后合成5-HT[19]。5-HT可诱导局部和系统的一些变化，其基本功能包括增加肠道分泌和运动，通过VN的传导来减缓胃排空和神经元间质细胞的表达[20]。有研究表明，来自人类和小鼠的孢子形成细菌增加了无菌小鼠结肠和血清5-HT水平，通过产生SCFAs，上调5-HT分泌以及肠内分泌细胞(enteral-endocrine cells，ECCs)中TPH1的表达，从而改善无菌小鼠相关的肠道运动障碍[21]，并且可以调节无菌小鼠肠内和血液5-HT水平[22-23]。在ENS中，肠道微生物群产生的SCFAs，直接刺激TPH1，导致 5-HT 合成和ECCs分泌增加，从肠内皮细胞基底膜释放的5-HT与游离的脂肪酸受体相互作用[24]。在CNS中，SCFAs通过VN传入神经向孤束核 (nucleus of the solitary tract，NTS) 和容纳大脑的大部分5-HT神经元的中缝背核 (dorsal raphe nucleus，DRN) 发出信号，从而影响大脑微环境。

2.2 短链脂肪酸SCFAs由乙酸、丙酸和丁酸组成，可以通过影响上皮细胞(epithelial cell，EECs)释放胃肠激素，影响树突状细胞调节免疫功能从而调节大脑的行为和认知功能。一项研究分析了783份粪便样本中的10 913个亚基因组，并发现了促进SCFAs生物合成的多种细菌途径，其潜在机制是醋酸盐饮食减少了淋巴组织中自身免疫T细胞，而丁酸盐饮食增加了调节性T细胞的数量和功能[25]。丁酸盐还可以促进紧密连接蛋白的表达并影响黏膜屏障功能，并且乙酸盐在降低黏膜通透性和增强肠屏障功能方面也有良好的表现[26-27]。目前，已有研究证实，SCFAs对肠道屏障具有保护作用，SCFAs缺乏会导致产生丁酸的细菌数量减少，从而导致肠道通透性改变。SCFAs的作用机制包括激活L细胞的G蛋白，促进胰高血糖素样肽-1(panylucagon-like peptide-1，GLP-1)和重组蛋白YY(recombinant peptide YY，PYY)的释放[24]，调节葡萄糖稳态[28]、IR和炎症反应、氧化应激等。人体研究也表明，SCFAs参与了早期人类DCD的预防机制，并证实了SCFAs对早期人类DCD的保护作用[24]。临床研究表明，膳食纤维可以促进微生物群产生SCFAs，且在DCD患者中SCFAs产生菌相对减少，将人体膳食纤维干预前后的肠道菌群移植到无菌小鼠体内，结果发现，肠道微生物群与改善纤维葡萄糖诱导的宿主血糖控制之间存在着显著的联系。同时，SCFAs 通过激活VN传入神经元，在肠道信息和大脑之间建立联系。

3 糖尿病认知障碍中“微生物-肠-脑轴”的改变

饮食习惯的改变和昼夜节律的紊乱，可能会导致肠道微生物群失衡，导致神经系统疾病的发生[29]。微生物群与大脑之间独特的双向交流可能在调节神经退行性疾病的发病率方面发挥关键作用[30]。微生物群诱导的5-HT效应及其对ENS的影响，可能会根据干预的性质和时间对神经发生、分化、细胞转换和肠道功能产生不同的影响[17]。微生物群失调不仅会诱导DM，还会加重DM晚期的DCD症状[4]，但其潜在机制还不明确。

3.1 微生物群在淀粉样蛋白β清除中的作用Aβ在脑组织和脑血管系统中的积累被认为是DCD主要病理生理机制。根据淀粉样蛋白假说，Aβ肽不溶性形式的过度产生或清除受损，触发导致神经炎斑块和神经原纤维缠结形成的神经毒性级联反应是DCD的病理标志[31]。最近的MGBA研究证明，微生物群可能与DCD中的Aβ通路有关，提供一种潜在的替代方法来改变大脑Aβ，能够有效改善DCD症状[32]。有证据表明，在MGBA之间的双向通信中，某些物质的干扰会使大脑和肠道产生神经炎症，例如脂多糖、Aβ和其他促炎分子，这些物质从肠道积聚，在肠道泄漏并扩散到全身和大脑，导致全身CNS炎症，造成DCD。有人假设Aβ与微生物群通过交叉播种，触发神经元蛋白质的错折叠，启动先天的免疫系统，并激活神经炎症。根据这一假设，Aβ会以一种类似朊病毒的方式扩散，在口服用药时，朊病毒会在卵泡树突细胞中积累并通过与卵泡的树突状细胞移动到ENS，从而扩散到大脑中。总之，微生物群的代谢物如脂多糖和Aβ可以通过各种机制改变DCD的Aβ稳态，针对Aβ靶向治疗，可能会延缓发作、降低发病率。益生菌补充剂可能会对DCD有治疗作用[33]。

3.2 微生物群对血脑屏障通透性的影响血脑屏障(blood brain barrier，BBB)由外周神经微血管内皮细胞(peripheral nerve microvascular endothelial cells，PnMECs)、神经内膜微血管的周细胞和基底膜组成，用于调节血液循环和脑间质液之间内源性化合物和外源性物质的转移。神经血管单元中的周细胞、星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞相互协助，共同抵御有害物质进入大脑。目前已有研究表明，微生物群失调会增加BBB通透性，BBB损伤已经被认为是DCD的一个关键因素。微生物群影响BBB通透性主要与以下几个方面有关：①PnMECs损伤。BBB的物理屏障由两部分组成：PnMECs和基底膜。BBB通过PnMECs上的物理屏障和离子电荷来实现其生理功能，DM和持续高血糖会导致肠道微生物群失调，从而诱发PnMECs功能障碍，增加血小板聚集，减少脑血流量和脑血管表面积，从而导致血管内皮增生和血浆黏度增加，最终造成大脑损伤。因此，保护PnMECs的完整性对减少DM后期大脑损伤具有重要作用[34-35]。②肠道渗漏。在肠道微生物群失调的情况下，病原微生物可能会常驻宿主体内，穿过受损的屏障，例如肠道屏障，到达血管内隔室并最终穿过BBB，进入大脑。肠道微生物群失调会使肠道通透性受损或肠道渗漏，导致Aβ、脂多糖和血清淀粉样蛋白 A(serum amyloid A，SAA) 进入肠道，造成促炎细胞因子水平异常，包括IL-6、IL-10、IL-12 p40、IL-17A、IL-22、IL-23p和TNF-α等[36]。BBB主要控制中枢Aβ，通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1)，负责脑到血液的流出，DM晚期，糖基化终产物的受体(receptors of the late glycosylated terminal products，RAGE)负责血液到大脑的流入[3，37]。根据神经血管假说，在DCD中，LRP1/RAGE 介导的转运失衡会导致Aβ大量积聚并诱发神经血管炎症。改变 LRP-1/RAGE 受体的比例，大脑中Aβ的积累会引发炎症，激活小胶质细胞和星形胶质细胞[38]。同时，AGEs 的积累会导致 BBB 基底细胞肥大，刺激外膜产生和分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，促进脑血管内皮细胞释放血管内皮生长因子和 MMP-2，导致 BBB 的破坏。③紧密连接蛋白的低表达。在无菌小鼠中，BBB通常在胚胎发育的第二周左右形成，在胚胎发育的第15天左右通透性急剧下降。然而，在胚胎发育第16天至第18天，GF小鼠胚胎表现出BBB通透性增加和紧密连接蛋白的低表达，这种效应在出生后和成年后一直维持，但通过出生后微生物群的再定居，可以恢复BBB的完整性，这意味着微生物群在BBB发育中有一定作用。BBB 的通透性在GF小鼠中显著增加，这归因于脑内皮细胞中紧密连接蛋白(例如，occludin1 和 claudin5)的下调，一旦GF小鼠被来自无病原体小鼠的菌群常规化，BBB的完整性就会显著增强。

3.3 微生物群失调与胰岛素抵抗DM是一种以IR为特征的进行性疾病，IR可能影响参与胰岛素信号传导的不同蛋白质以及其他机制[39]。胰岛β细胞分泌的胰岛素，在调节血糖代谢中起核心作用，循环胰岛素可以穿过BBB，其受体在海马区的突触中大量表达[40]。胰岛素信号在大脑中抑制糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3)引起tau蛋白磷酸化以诱导神经原纤维缠结[41]，影响神经元新生，导致DCD。研究表明，CNS中的胰岛素信号参与了认知和神经元可塑性的调控[42]，胰岛素在CNS中可以减轻脑炎症并保持记忆功能[43]。脂多糖、SCFAs和胆汁酸是DM的主要调节因子，LPS与Toll样受体4结合，引起轻度炎症和IR[26，44]。胆汁酸由肝脏合成，并通过微生物群的代谢转化为次级胆汁酸，次级胆汁酸激活法尼醇X受体，诱导成纤维细胞生长因子分泌增加，次级胆汁酸激活G蛋白偶联受体，刺激肠L细胞分泌GLP-1。SCFAs激活L细胞，促进GLP-1和肽YY的释放，提高胰岛素敏感性[24，45]。综上所述，肠道微生物失调产生SCFAs，脂多糖使机体发生IR，从而导致DCD发生。

4 糖尿病认知障碍中微生物群的调节作用

研究发现，微生物群可能参与DCD的进展。为分析伴或不伴认知功能障碍的DM患者微生物群的多样性。Zhang等[4]采用16sRNA序列测定154例DM患者微生物群组成，结果表明，在154例DM患者中，有73例认知功能正常，1例认知功能障碍，其中DCD患者的血红蛋白，高密度脂蛋白和软骨素丰度相对较低。此外，DCD组钙信号通路和肾素-血管紧张素系统上调，而促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GNRH)信号、内吞作用、异黄酮生物合成和细胞色素P450下调[46]。山药粥是由山药制成的经典药膳，能增加双歧杆菌的含量，调节氧化应激，降低空腹血糖水平。Pang等[47]报道了关于山药粥对链脲佐菌素(streptoluzoonin，STZ)诱导的T2DM大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤认知功能的影响，并探讨了MGBA在这一过程中的作用机制，发现山药粥可以改善认知功能，增加益生菌(双歧杆菌、乳杆菌、瘤胃球菌、和梭菌)的相对含量，增加肠道和大脑皮层的SCFAs，减轻氧化应激和炎症反应，促进神经递质和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达。因此，山药粥对认知功能有保护作用，其机制与MGBA有关。

认知功能下降是DM晚期的常见症状，但其潜在发病机制尚不清楚[48]，有文章报道，猩猩、大鼠、小鼠、果蝇、仓鼠、斑马鱼、蚂蚁、果蝇均可作为研究肠道微生物群的模型[49-50]，发现无菌小鼠和正常小鼠相比，它们的体脂和IR低于正常小鼠，并且无菌小鼠的胰岛素和葡萄糖耐受性高于正常喂养的小鼠。实验显示，移植了改变微生物群的无菌小鼠肥胖显著增加，并伴有相关的IR和CD表现[51]。Gao等[48]研究了DCD大鼠和年龄匹配的对照组血清和海马肠道微生物群与代谢的相关变化，并探讨了MGBA影响DCD的机制。①采用Morris水迷宫实验观察DCD大鼠的学习和记忆表现发现DCD大鼠学习和记忆能力受损。②使用16S rRNA 基因测序及其Alpha多样性进行评估发现，DCD大鼠微生物群丰度下降。③分析健康人血清和海马的典型1H NMR 谱图发现了特殊代谢表型，其特征是三羧酸减少，氨基酸、胆碱代谢、谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环以及星形胶质细胞-神经元代谢紊乱。④使用Spearman相关分析评估发现，DCD大鼠的微生物代谢物干扰并改变了宿主的新陈代谢并导致认知下降。因此，通过调节微生物群来改变宿主代谢可能是一种新的预防和治疗途径。

迄今为止，在各种干预研究中，FMT、饮食和益生菌治疗被认为是有效的[52-53]。在一项针对IR男性的随机、双盲对照实验中，患者接受了来自瘦体质量捐赠者的肠道微生物群，对实验结果的分析表明，FMT提高了胰岛素敏感性，丁酸产生菌的数量也显著增加。益生菌、益生元和合生元的补充对各种肠道病原体显示出良好的效果，因为它们能够与病原微生物竞争粘附位点，疏离病原体或刺激，通过启动宿主肠道内外特定基因的激活来调节宿主的免疫应答[54]。益生菌对宿主有广泛的影响，包括改善胰岛素敏感性的调节，这也可能与微生物群平衡介导的宿主代谢、改善宿主代谢成分、减少促炎细胞因子和降低肠道通透性有关[55]。益生菌可以调节宿主的免疫反应，激活特定的基因，影响肠外过程[56]。益生菌也被证明可以调节DCD和刺激肠道血管生成[44]。益生元能促进有益细菌如双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，对改善失调及其相关炎症状态发挥有益作用。益生元也对CNS有积极的影响，可能在认知障碍、焦虑和抑郁的调节中起关键作用[57]。研究表明，摄入酸奶等发酵乳制品可以将乳酸菌输送到肠道，改变微生物群组成，抑制脂多糖的产生，增加肠道上皮细胞的紧密联系。虽然现在的各种干预手段都能通过改变微生物群组成，调节肠道与大脑的双向通讯，但具体的机制仍然不明确，未来期望通过前期干预微生物群组成改善DCD。

5 小结

慢性高血糖和IR是引发DCD的主要因素，神经递质异常、BBB损伤和炎症反应也有助于糖尿病引起神经元损害和DCD。回顾以上的文献，有研究通过微生物群调节、糖代谢调节、改善IR、减少脑内Aβ沉积和减轻炎症反应来限制神经变性和DCD，减缓DCD以及与DM有关的并发症，但肠道微生物代谢物如何通过肠屏障和血脑屏障进入大脑发挥其调节作用的分子机制尚不明确，肠道微生物代谢物影响血液中哪些炎症因子的高表达从而促发全身炎症反应仍不清楚，并且治疗DCD的药物疗效并不显著，本文总结了MGBA参与调控DCD的相关影响因素，提示异常的微生物群可能是DCD潜在发病机制。