钙卫蛋白与脓毒症关系研究进展

高榕悦， 韩玉珍， 李文雄， 黄立锋

脓毒症(sepsis)是感染引起的宿主反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，在重症监护病房中有着极高的发病率和病死率[1]。机体免疫功能紊乱在脓毒症发病过程中起到重要作用，主要表现为促炎作用与免疫抑制作用失衡，目前尚缺乏有效的预防和干预手段。钙卫蛋白(calprotectin)广泛分布于人体细胞、组织及体液中，是一种重要的炎性反应蛋白。多项研究[2-4]表明，钙卫蛋白与机体发生脓毒症密切相关，在调节促炎反应、抑炎反应中均发挥作用。本文拟就钙卫蛋白在脓毒症发病过程中所起到的作用做一综述。

1 钙卫蛋白的结构与生物学功能

1.1钙卫蛋白的结构 钙卫蛋白是一种来源于中性粒细胞和单核细胞的蛋白，属于骨髓相关蛋白家族(myeloid related protein， MRP)，因此也被称为Mrp8/14。Mrp8和Mrp14是中性粒细胞细胞质中含量最丰富的胞质蛋白，在细胞应激时，这两种蛋白可结合形成Mrp8/14异源二聚体，再由细胞内释放到外周血[5]。钙卫蛋白同时又属于S100家族，是一个相对分子质量为36 kD的钙-锌结合蛋白异二聚体，由分子量分别为14 kD的重链(S100A9)和8 kD的轻链(S100A8)以共价键连接而成[6]。为了称呼的标准化，通常人们把这种能与钙结合的蛋白称为钙卫蛋白。

1.2钙卫蛋白的生物学功能

钙卫蛋白广泛分布于人体细胞、组织及体液中，在血清、粪便等标本中均可检测到, 且不同部位钙卫蛋白的含量各不相同。在中性粒细胞中，钙卫蛋白主要存在于溶菌酶外的细胞质中，在早期炎症浸润阶段，钙卫蛋白单体可结合钙离子形成钙卫蛋白异二聚体，向细胞骨架和细胞膜转移。在正常状态下，皮肤黏膜的鳞状上皮细胞也可检出胞浆钙卫蛋白的表达。

钙卫蛋白也是一种重要的炎性反应蛋白。多项研究[2]表明，钙卫蛋白具有调节免疫、参与炎症反应以及抗微生物等活性。钙卫蛋白可刺激免疫球蛋白的生成、趋化因子的活化及中性粒细胞固定因子的活化，从而发挥调节炎症反应的作用。此外，有研究[7]证实，钙卫蛋白可通过鳌合二价阳离子来抑制金属蛋白酶活性，进而发挥其抑菌活性。钙卫蛋白还可作为炎性疾病的标志物, 在临床多种疾病(炎性肠病、肝病、自身免疫性疾病等)的诊断和鉴别诊断、预测复发、监测疗效等方面发挥重要作用。近年来人们发现，在脓毒症时，钙卫蛋白表达水平可明显升高(正常人的血清钙卫蛋白浓度通常低于1 μg/mL，发生脓毒症时可升高100倍[3,8])。进一步研究[2-4]表明，钙卫蛋白可通过Toll样受体4(toll-like receptor 4， TLR4)、晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products， RAGE)等通路，介导下游信号转导，进而激活免疫效应细胞，故其与机体发生脓毒症密切相关。

2 钙卫蛋白在脓毒症发病过程中的作用机制

2.1脓毒症时免疫学变化特征

脓毒症是感染引起的宿主反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，在重症监护病房中有着极高的发病率和病死率[1]。虽然由细菌引发的炎症反应有利于根除病原体，但复杂而持久的宿主反应，在组织损伤、多系统器官功能衰竭和脓毒症死亡的发病机制中同样发挥重要作用。

在脓毒症的发生过程中，机体固有免疫可出现紊乱。在脓毒症发生早期，血液中成熟中性粒细胞数量增加并聚集于感染部位。但随着脓毒症的进展，中性粒细胞迁移能力减弱且凋亡增加。此外，在脓毒症发病初始阶段，M1型巨噬细胞释放大量促炎细胞因子；在脓毒症后期，机体则易出现免疫抑制与继发感染，这与巨噬细胞凋亡增加及其向M2型方向极化密切相关。脓毒症时，树突细胞的成熟和活化也受到抑制，可促进抑炎细胞因子的分泌，抑制机体免疫反应。

除固有免疫外，脓毒症时机体获得性免疫亦会出现紊乱。研究表明，脓毒症时B细胞数量明显减少，且存活的B细胞抗原呈递能力减弱，其活性和增殖能力均降低。相关研究也发现，脓毒性休克的发生亦与调节性B细胞密切相关。调节性B细胞可通过同源抑制、细胞接触介导抑制、旁路抑制和间接抑制四种途径发挥其免疫抑制效应。此外，脓毒症时T淋巴细胞凋亡明显增加，辅助性T淋巴细胞亚群比例失衡且调节性T细胞分化增加。未成熟的辅助性T淋巴细胞激活后，可分化为另一促进细胞免疫和体液免疫的细胞亚型，从而调控脓毒症患者机体免疫应答。调节性T细胞则可抑制其他T细胞亚群的免疫反应，分泌抑炎细胞因子。T淋巴细胞形态和功能变化是脓毒症后期机体发生免疫麻痹的重要作用机制。

2.2钙卫蛋白在脓毒症中的作用机制

2.2.1 钙卫蛋白的抗菌活性

高浓度的钙卫蛋白与二价阳离子螯合，可对多种细菌生长表现出抑制作用。有研究[5]表明，Mrp14基因敲除[Mrp14(-/-)]小鼠发生炎症反应时不能形成Mrp8/14异源二聚体，所以在感染肺炎克雷伯杆菌并导致脓毒症时，与野生型小鼠相比，Mrp14(-/-)小鼠体内细菌播散加剧，器官损害程度也更重，生存率更低。进一步体外实验发现，重组Mrp8/14异源二聚体(而非单独的Mrp8或Mrp14蛋白)，可通过二价阳离子螯合方式，表现出对克雷伯杆菌生长的抑制作用。研究者通过提取小鼠的中性粒细胞胞外杀菌网络(neutrophil extracellular traps， NETs)发现，野生型小鼠的NETs可明显抑制克雷伯杆菌生长，而Mrp14(-/-)小鼠的NETs则无此作用。在人类NETs中加入抗Mrp14抗体或金属锌以抑制钙卫蛋白与金属螯合，可明显减弱人类NETs杀灭克雷伯杆菌的能力。由此得出结论，钙卫蛋白可与金属螯合产生抗菌活性，从而在肺源性肺炎克雷伯杆菌脓毒症中发挥肺保护作用。

另有研究[7]发现，母乳可对锰敏感细菌(如金黄色葡萄球菌和B族链球菌)的生长产生抑制作用，而钙卫蛋白被耗竭的母乳则对上述两种细菌的抑制作用明显减弱，且这种抑制作用与锰含量呈明显正相关。这表明母乳中的钙卫蛋白可螯合锰离子，这是其产生抗菌活性的重要机制。

2.2.2 钙卫蛋白的促炎作用

有实验[9]发现，缺失Mrp8/Mrp14复合体的小鼠在感染大肠埃希菌后不易发生脓毒症，使用内毒素刺激后也不会发生致命性休克。这是因为缺失钙卫蛋白后避免了这种过度的炎症反应。研究[2,10]表明，当机体受到损伤或感染时，会大量释放Mrp8和Mrp14两种蛋白，二者形成的Mrp8/Mrp14复合体能放大内毒素触发的吞噬细胞炎症反应。钙卫蛋白参与了白细胞募集和细胞因子分泌，在调节炎症反应和组织损伤中能够发挥关键作用。

在脓毒症发病过程中，Mrp8/Mrp14复合体可作用于TLR4，促进炎症反应。在这一反应中，Mrp8是复合体的活性成分，可作为TLR4的内源性激活物，致肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)表达增加，从而发挥其促炎作用，而Mrp14则在其中发挥调节Mrp8功能的作用。此外，Mrp14还可作用于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3)通路，造成炎症反应[11]。研究发现，经过脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)处理后，小鼠肺组织中Mrp14表达上调，而通过抑制Mrp14可抑制NLRP3的表达，减弱LPS攻击小鼠肺部造成的炎症反应和细胞凋亡。反之，在抑制Mrp14的同时，促使NLRP3过表达，又可减轻其对炎症反应的抑制作用，这从另一角度证实了Mrp14可通过作用于NLRP3信号通路，促进LPS诱导的肺损伤。RAGE通路受体也是脓毒症发病过程中固有免疫反应的关键组成部分[12]。研究发现，在脓毒性休克患者中，RAGE和钙卫蛋白表达均明显增加，而钙卫蛋白是激活RAGE通路的主要因素，与脓毒性休克的发病密切相关。

有实验[5]发现，缺乏Mrp14的巨噬细胞对肺炎克雷伯杆菌的吞噬能力减弱，这表明钙卫蛋白可影响巨噬细胞功能。进一步研究[13]表明，在脓毒症早期，钙卫蛋白能够促进巨噬细胞发生M1极化，释放大量促炎细胞因子，这是脓毒性脑病(sepsis associated encephalopathy， SAE)发病的重要机制之一。通过研究SAE记忆损害的小鼠脑组织发现，组织中M1型小胶质细胞增加，M2 型明显减少。而抑制脓毒症小鼠Mrp14表达时，M1型小胶质细胞可转化为M2型，同时观察到小鼠的生存率、学习与记忆障碍能够得到明显改善。

2.2.3 钙卫蛋白的免疫抑制作用

血清高钙卫蛋白含量可通过抑制特定炎性单核细胞群扩增、诱导吞噬细胞低反应性发挥免疫抑制作用。这种免疫抑制作用在某些情况下起到保护作用，有时又促进了脓毒症患者的死亡。既往有研究[14]认为，新生儿脓毒症高死亡风险是因为先天免疫细胞的反应不良，然而关于脓毒症新生儿高炎症反应状态的临床观察结果与这一传统观念相悖。研究发现，新生儿具有选择性、短暂的微生物无应答性，而这种无应答性在允许充分的免疫保护的同时，又阻止了新生儿体内有害的高炎症反应。新生儿出生后，血清钙卫蛋白含量迅速升高，在出生后的第一个月内缓慢下降，然后达到与成人血清正常值相当的水平[7]。多项研究表明，新生儿的高钙卫蛋白水平在炎症反应过程中发挥保护作用。

有动物实验[15]表明， Mrp14(-/-)新生小鼠的CD11b+/Gr-1int/Ly6G-/Ly6Chi单核细胞(一种炎性单核细胞群)过度扩增，促进了脓毒症病程中剧烈的炎症反应。若出生后立即用钙卫蛋白处理Mrp14(-/-)新生小鼠，防止这种炎性单核细胞群过度扩增，则可降低动物脓毒性休克的致死率。如果钙卫蛋白未抑制这种炎性单核细胞群体的扩增，则会加速新生小鼠脓毒症的死亡进程。新生儿血清钙卫蛋白浓度增加，除了抑制特定炎性单核细胞群扩增外，还可导致吞噬细胞低反应性，通过调节新生儿在全身感染与无菌炎症中的敏感度，以发挥其保护作用[16]。动物实验[17]表明，钙卫蛋白可通过TLR4通路，影响染色质修饰，诱导吞噬细胞低反应性，进而提高脓毒性休克小鼠的生存率。

在新生儿脓毒症发病过程中，钙卫蛋白在不影响病原体防御的情况下阻止了剧烈炎症反应发生，对机体具有保护作用。然而针对小鼠脓毒症后期和成年脓毒症患者的研究[18-19]发现，髓系来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell， MDSC)中Mrp14含量较高，起到了免疫抑制作用，是造成脓毒症高病死率的原因之一。在脓毒症疾病进展过程中，钙卫蛋白这一炎症反应蛋白究竟如何发挥免疫抑制作用，引起人们广泛关注。研究[20]发现，在脓毒症后期小鼠MDSC中，长链非编码RNA Hotairm1通过与Mrp14结合并穿梭于细胞质和细胞核间，将Mrp14由促炎因子转换为免疫抑制因子。在脓毒症后期小鼠MDSC脱落的外泌体中，可检测到较高的Hotairm1水平。而敲除小鼠MDSC的Hotairm1，能防止脓毒症早期Mrp14在细胞质与细胞核间的转移，减少对免疫细胞的抑制。此外，白细胞介素(IL)-6和IL-10可激活小鼠MDSC中Mrp14的表达， IL-10还可诱导Mrp14核定位，从而起到免疫抑制作用[21]。

此外，MDSC中的Mrp14可通过多种途径促进免疫抑制作用。Mrp14蛋白从MDSC的细胞质转运至细胞核，能促进免疫抑制介质，如微小RNA(miR)-21和miR-181b的表达，从而加强MDSC的免疫扩增和抑制作用[18-19]。Mrp14还能与信号传导及转录激活蛋白3(Stat3)-CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)蛋白复合体结合并增强其稳定性，使其发挥激活miRNA启动子的作用，进而将Gr1+CD11b+细胞转换为有免疫抑制作用的MDSC表型。多项研究证明，靶向抑制Mrp14介导的免疫抑制通路，可明显改善脓毒症小鼠的生存率。

3 钙卫蛋白与脓毒症的关系及其临床意义

3.1钙卫蛋白对脓毒症发生的预测价值

钙卫蛋白广泛分布于人体的各种体液和分泌物中，是全身炎症的敏感标志物。研究[22]发现，血液、腹水、羊水等体液中的钙卫蛋白含量均对脓毒症的发生、发展具有预测价值。多项体外实验、动物实验与临床研究[23-24]均证明，在细菌感染早期，患者血清钙卫蛋白水平即开始增加，在脓毒症全程一直处于较高水平，明显高于病毒感染者与健康对照者。研究者同时测定了患者的中性粒-淋巴细胞计数比值(neutrophil-lymphocyte count ratio， NLCR)和降钙素原(procalcitonin， PCT)水平，发现血清钙卫蛋白水平对细菌脓毒症的预测效能优于这两项传统指标，只是对于快速预测抗菌药物治疗效果时稍显逊色[25]。

另有一项前瞻性队列研究[26]发现，腹水钙卫蛋白增加(≥550 ng/mL) 是肝硬化自发性细菌性腹膜炎复发率增加的独立危险因素，而复发患者最常见死亡原因是脓毒症相关的器官功能障碍。此外，羊水Mrp8浓度对早发型新生儿脓毒症的发生也有预测价值[27]。

3.2钙卫蛋白对脓毒症诊断价值 研究[28]发现，ICU患者血清钙卫蛋白浓度升高可早期诊断脓毒症，且优于传统炎性指标PCT。测定Mrp8浓度在SAE的诊断中也有较高特异度[13]。此外，血清钙卫蛋白的动态变化对脓毒症也具有诊断价值[29]。通过研究术后ICU患者发现，术后当天与第3天血清钙卫蛋白含量的差值对脓毒症的诊断准确度较高(敏感度87%，特异度89%)。在基因层面，同样有相关研究可证明钙卫蛋白对脓毒症的诊断价值。对脓毒症患者与健康志愿者血样的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测结果表明，血液中Mrp8基因水平明显上调[30]。

3.3钙卫蛋白对脓毒症预后的预测价值

危重脓毒症患者血清中钙卫蛋白含量明显增加，且随着脓毒症病情的加重而升高[31]。研究发现，确诊脓毒症30天内死亡的患者，其入ICU时钙卫蛋白浓度明显高于存活者，说明初始高水平钙卫蛋白浓度预示着较高的远期死亡风险。在预测脓毒症患者远期病死率时，血清钙卫蛋白浓度与传统指标相比有其独特的优点。与血清PCT浓度、急诊脓毒症病死率评分相比，钙卫蛋白在预测患者28天病死率时更为准确[28,31]。当脓毒性休克患者序贯器官衰竭(SOFA)评分相似时，较高的血清钙卫蛋白水平可提示更高的死亡风险[32]。还有研究分析了钙卫蛋白浓度变化对患者预后的影响，发现入ICU第一周内血清钙卫蛋白浓度增加，将预示患者的整体生存率得到改善，此结论与前述研究结果相悖，提示钙卫蛋白在脓毒症不同阶段所发挥的作用可能不同，具体机制有待深入阐明[33]。

钙卫蛋白水平升高，还可预测脓毒症相关急性肾损伤的发生以及SAE的严重程度[31,34]。实验[13]测定发生SAE小鼠的脑组织钙卫蛋白表达含量时发现，病死小鼠脑组织钙卫蛋白含量明显高于存活小鼠。此外，SAE患者外周血Mrp8水平升高，可能与SAE的严重程度有关，并可预测SAE患者的预后。总之，测定患者血清钙卫蛋白浓度，有助于将脓毒症患者进行危险分层，以提供更高级别的护理和治疗方案。

3.4钙卫蛋白是脓毒症的潜在治疗靶点

钙卫蛋白能与锌螯合，具有抗菌活性，为脓毒症治疗提供新思路。有研究[35]将罹患脓毒症的新生儿在发病早期随机分为两组即对照组和补锌组，两组除是否补锌差别外，其余治疗相同。结果发现，与对照组相比，补锌组的血清锌水平明显升高，S100A8基因下调三倍，S100A9基因上调两倍，提示补锌可能会调节新生儿脓毒症途径中相关免疫基因的表达。另有研究[36]发现，接受补锌治疗的脓毒症新生儿，其血清钙卫蛋白和炎性细胞因子水平明显降低，且病死率也较低，但补锌组的病死率降低无统计学意义，故这一治疗思路还有待进一步临床验证。

有学者认为，抑制钙卫蛋白的促炎作用也是一种治疗脓毒症的思路。有研究[37]发现，在盲肠结扎穿孔脓毒症模型中，迷走神经电刺激可明显降低血清S100A8和肝RAGE的表达，缓解动物低血压并减轻其肝损害。进一步研究证实，使用α-银环蛇毒素进行预处理，可逆转迷走神经电刺激的抑制作用，而使用抗RAGE抗体预处理则可将其增强。总之，迷走神经电刺激可通过减少S100A8的产生，而对大鼠脓毒性休克产生保护作用。此外，使用水仙环素，也可通过抑制钙卫蛋白、促炎细胞因子、抑制核因子-κβ(NF-κβ)信号通路等途径，对脓毒症新生大鼠起到保护作用[6]。

综上所述，钙卫蛋白是一种重要的炎性因子，具有抗菌活性和调节机体炎症反应的作用。目前已有大量研究表明，钙卫蛋白在脓毒症发病过程中具有重要作用，并有一定的脓毒症诊断、预测和治疗价值。然而，由于其在脓毒症发病过程中的确切作用机制尚未完全阐明，若要将钙卫蛋白广泛应用于临床，还需开展更加深入的基础与临床研究。