HT患者外周血淋巴细胞Fas/FasL水平与自身抗体水平的关系

吴海花 熊萍 王瑶 张倩莹 赵伟 文金辉 苟晓琴

桥本甲状腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT）是一种慢性自身免疫性甲状腺炎症，多发于30～50 岁的女性人群［1］。该病与机体的免疫系统异常有关，主要是由于人体血液中存在攻击甲状腺的自身抗体，同时还存在诱导细胞凋亡的多种细胞因子和补体，这些成分攻击甲状腺细胞，导致机体的甲状腺滤泡受到不同程度的炎症破坏，影响甲状腺激素的分泌和释放，从而导致患者身体出现不适症状［2-3］。早期HT 患者通常没有临床不适症状，随着炎症的缓慢进展，患者可出现不同程度的甲状腺肿大、结节、甲状腺功能减退等表现［4］。HT 很难治愈，目前临床上无法针对该病进行彻底的根除治疗［5］。早期诊断、及时防控HT 十分重要。自身抗体如血清甲状腺球蛋白抗体（Anti-thyroglobulin antibodies，ATG）、甲状腺过氧化物酶抗体（Thyroid peroxidase antibody，ATPO）被证实是HT 发生的危险因素，临床常采取这些指标评估HT。近年来有研究认为，HT 患者的外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平与HT 患者的病情进展密切相关［6］。本研究将通过直接荧光免疫标记法检测HT 患者外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平，并分析Fas/FasL 水平与自身抗体水平的关系，揭示HT 发病的免疫学机制，以期为临床免疫干预治疗方案的制定提供一定的参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月至2020年9月于成都大学附属医院进行甲状腺检查的患者84 例，根据临床检查结果分为HT 组（n=44）和单纯甲状腺肿（NTG）组（n=40）。HT 组女性29 例，男性15 例；平均年龄（39.48±5.27）岁。NTG 组女性27 例，男性13 例；平均年龄（40.17±5.33）岁。另外选取同期健康体检者45 例作为对照组，女性27 例，男性18例；平均年龄（38.76±5.13）岁。三组受试者基础资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。HT 组患者纳入标准：患者符合HT 诊断标准［7］，经B 超、化验等检查确诊，且均为初诊患者；无其他免疫系统疾病；资料完整。NTG 组患者纳入标准：患者符合NTG 诊断标准［7］；患者无其他内分泌疾病。HT组、NTG 两组均排除以下患者：合并恶性肿瘤者；严重性全身感染者；严重性器质性疾病或严重糖尿病患者。本研究经院医学伦理委员会批准通过，受试者已签署知情同意书。

1.2 检查方法

血清ATG、ATPO、游离三碘甲状腺原氨酸（Free Trnodothyronine，FT3）、游离四碘甲状腺原氨酸（FreeTIhyroxine，FT4）、促甲状腺激素（Thyroid stimulating hormone，TSH）的检测：清晨空腹静脉抽取受试者的外周血5 mL，离心8 min（转速3 000 r/m，离心半径10.00 cm）后吸取上层的血清于无菌EP 管，-70℃冰箱保存待测，采用SMART 6500 全自动化学发光免疫分析仪及相关配套试剂（美国贝克曼，规格型号DXI800）进行检测，5 个自身免疫指标均采用免疫化学发光法进行检测。

Fas/FasL 水平检测方法：取100 μL 抗凝血，加入红细胞裂解液，所得淋巴细胞分别加入5 μL抗-CD3、抗-CD95、抗-CD178 单抗，室温孵育30 min，进行离心、洗涤，弃上清液，用PBS 重悬细胞制成单细胞悬浮液，4℃保存待测。采用直接荧光免疫标记法，以鼠抗人CD3-FITC/CD95-PE-Cy7/CD17-PE 三色荧光标记单克隆抗体，根据T 淋巴细胞表面特异性标记CD3+T 淋巴细胞的比例，以Fas%，FasL%表示，并用二维散点图和数据形式表示，对凋亡淋巴细胞进行快速定量分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析，计量资料采用（）表示，行t检验，外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平与患者自身抗体水平的关系采用Pearson相关性进行分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清自身抗体水平比较

三组血清自身抗体ATG、ATPO 水平比较：HT组＞NTG 组、对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），NTG 组、对照组间ATG、ATPO 比较差异无统计学意义（P＞0.05）。三组FT3、FT4、TSH 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 三组血清自身抗体水平比较（±s）Table 1 Comparison of serum autoantibody levels among the three groups（±s）

表1 三组血清自身抗体水平比较（±s）Table 1 Comparison of serum autoantibody levels among the three groups（±s）

组别HT 组NTG 组对照组F 值P 值n 44 40 45 ATG（mIU/L）222.15±76.95 3.24±0.34 2.38±0.13 345.198＜0.001 ATPO（mIU/L）295.72±89.54 8.05±1.13 7.21±2.34 439.428＜0.001 FT3（pg/mL）3.04±0.54 2.98±0.47 3.00±0.31 0.197 0.822 FT4（ng/dL）0.95±0.17 1.00±0.14 0.99±0.32 0.581 0.561 TSH（mIU/L）3.05±0.59 2.97±0.97 3.10±1.00 0.240 0.787

2.2 三组外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平比较

三组外周血淋巴细胞中Fas、FasL 表达阳性率比较：HT 组＞NTG 组＞对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 三组外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平比较（±s）Table 2 Comparison of Fas/FasL in peripheral blood lymphocytes among the three groups（±s）

表2 三组外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平比较（±s）Table 2 Comparison of Fas/FasL in peripheral blood lymphocytes among the three groups（±s）

注：与对照比较，aP＜0.05；与NTG 组比较，bP＜0.05。

组别HT 组NTG 组对照组F 值P 值n 44 40 45 Fas（%）79.32±9.13ab 57.14±8.25a 43.25±5.74 240.689＜0.001 FasL（%）3.66±0.85ab 2.74±0.63a 1.51±0.47 116.008＜0.001

2.3 HT 患者外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平与ATPO、ATG 水平的相关分析

Pearson 相关性分析结果显示，HT 患者外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平与ATG、ATPO 表达成正相关（P＜0.05）。见表3。

表3 HT 患者外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平与ATPO、ATG 的Pearson 相关性Table 3 Pearson correlation analysis of Fas/FasL in peripheral blood lymphocytes，ATPO and ATG in patients with HT

3 讨论

HT 是常见的甲状腺炎症，不恰当的碘摄入以及遗传因素是诱发HT 的重要原因。存在碘脱逸状态的HT 患者还伴有甲亢或甲减，病理检查可显示甲状腺肿大、正常甲状腺萎缩以及间质淋巴组织增生。近年来，因HT 合并甲状腺癌的发病率逐渐升高，HT 也逐渐得到关注。HT 起病隐匿、发展缓慢［8］，目前临床中并无较好的预防和治疗方法。进一步了解HT 患者自身免疫状态的变化情况，或可为临床诊治、预防提供参考。

HT 的病因尚不明确，研究显示其可能与机体的免疫被破坏有关，对HT 患者甲状腺的免疫应答生理过程进行探讨或有利于其临床诊断和治疗［9］。ATG、ATPO 为常见的自身抗体，被认为是自身免疫性甲状腺疾病临床诊断的重要指标［10］，可反映机体甲状腺免疫情况［11］，推测ATPO、ATG 水平与HT 病情程度相关。本研究结果显示，HT 组患者的血清ATG、ATPO 浓度高于NTG 组、对照组，与相关临床报道一致［12］。这是因为HT 属于免疫性疾病之一，患者通常伴有甲状腺抗体升高症状，HT 患者免疫系统错误将甲状腺球蛋白视作敌人而产生自卫行为，因此血清ATG 浓度会升高；HT 患者免疫功能紊乱，可破坏甲状腺过氧化物酶，ATPO 作为甲状腺自身免疫性抗体，与甲状腺过氧化物酶结合可破坏甲状腺，最终导致甲状腺炎，因此HT 组患者的ATPO 血清浓度偏高。本研究各组FT3、FT4、TSH 水平比较差异无统计学意义，由此可见单纯甲状腺肿、桥本甲状腺炎者与健康机体的基线甲状腺功能并无显著差异。

Fas/FasL 是近年来研究得最为深入的有关细胞凋亡的膜表面分子。人Fas、FasL基因分别分布在10 号染色体q23、1 号染色体q23 上，长度分别为25 Kb、8 Kb 左右。当Fas/FasL 系统功能发生障碍时，活化的T 细胞就会堆积在体内，引起自身免疫性疾病，因此推测Fas/FasL 所介导的生理反应或与免疫相关疾病发生过程有关［13-14］。Fas、FasL 分别为Ⅰ型跨膜受体蛋白、Ⅱ型跨膜蛋白，前者为TNFR/NGFR 超家族成员，广泛表达于上皮细胞、T/B 淋巴细胞表面，是FasL 的受体；后者为TNF 超家族成员，被称为死亡因子，可表达于T 淋巴细胞、B 细胞表面［15］。Fas 在血清中的可溶性形式即sFas，其通过和Fas 竞争性结合细胞表面FasL 定点以达到间接阻断细胞凋亡的目的，血清FasL 存在免疫活性。动物实验显示HT 大鼠中血清Fas、FasL 水平相比正常组显著升高，Fas、FasL 可通过调控自身免疫水平参与HT 发病［16］。本研究中，HT 组患者外周血淋巴细胞Fas、FasL 表达水平均高于健康人群、NTG 患者，提示Fas/FasL 可能通过调控机体免疫参与HT 发病过程，与余欣然等［18］的研究结果相似。进一步Pearson 相关性分析显示，HT 患者外周血淋巴细胞Fas/FasL 水平与ATG、ATPO 表达成正相关，提示Fas/FasL 水平可能与自身抗体相关指标协同参与HT 发病。

综上所述，HT 患者外周血淋巴细胞Fas/FasL表达水平异常升高，且与ATG、ATPO 水平相关，检测外周血淋巴细胞Fas/FasL 表达水平或许可为HT 诊断、治疗提供重要依据。