NLRC3在宫颈CIN病变中表达及临床价值

张建海 王巍 王前 许佳伦 高娜

宫颈癌在女性恶性肿瘤中发病率较高，据2019年全国癌症报告，宫颈癌发病约占6.25%，病死率约占3.96%，相较于卵巢癌、子宫内膜癌等均更高，分别位于第6 位与第8 位；并且宫颈癌发病呈现出年轻化趋势，严重威胁着女性健康。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）为宫颈癌前病变，高级别鳞状上皮内病变（highgrade squamous intraepithelial lesion，HISL）发生可加速宫颈癌癌前病变进程，使宫颈癌发病风险明显增加［1-2］。故而，通过早期诊断宫颈CIN 病变，有效阻断宫颈病变，并提高宫颈癌筛查效果具有重要临床意义。宫颈细胞学筛查常用于宫颈病变诊断，但是该方法假阴性率相对较高［3-4］。肿瘤微环境改变与肿瘤发生发展及转移联系紧密，免疫炎性微环境在宫颈癌发生中承担着重要作用［5］。模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）为宿主固有免疫系统关键组成，胞浆PRRs 主要为NOD 样受体（NOD-like Receptors，NLRs）。NLRC3属于NLR 家族，可参与调控NF-κB 信号通路，进而对肿瘤发生发展产生影响。诸多研究［6-7］表明，NLRC3 与炎症反应存在关联，可对炎症信号通路进行负性调控，其功能失调与多种自身免疫性疾病及结肠癌、肺癌等肿瘤相关。近些年有研究［8］表明，NLRC3 可参与子宫内膜癌的发生发展。但目前，NLRC3 调控宫颈病变发生发展的机制尚未明晰。本研究分析NLRC3 表达与宫颈CIN病情的关系，探究其预测CIN 发生及诊断HISL 的效能，旨在为宫颈癌前病变筛查及诊疗提供支撑。报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取北京市大兴区中西医结合医院2021年3月至2022年2月宫颈CIN 患者96 例为观察组，均经细胞学以及病理检查明确诊断。年龄平均（30.26±3.52）岁，体质量指数（body mass index，BMI）平均（22.36±2.11）kg/m2，有生产史63 例。根据世界卫生组织（world health organization，WHO）CIN 分级标准［9］进行划分，CIN1（35 例）：轻度非典型增生，细胞异型程度较轻，排列整齐性较差，但仍有极性，异常增殖细胞范围仅局限于上皮层1/3；CIN2（42 例）：中度非典型增生，异型程度明显，排列紊乱，异常增殖细胞范围延伸至上皮层下2/3；CIN3（19 例）：重度非典型增生，异型程度显著，极性丧失，异常增殖细胞扩展范围近乎全层。CIN1归为低级别鳞状上皮内病变（LSIL），CIN2、CIN3 归为高级别鳞状上皮内病变（HSIL）。见图1。

图1 宫颈上皮内瘤变组织学染色（HE，×20）Figure 1 Histological staining of cervical intraepithelial neoplasia（HE，×20）

纳入标准：①经细胞学、病理检查明确诊断为宫颈CIN［10］；②年龄18 岁以上；③纳入本研究前未用药治疗。排除标准：①宫颈手术既往史；②合并恶性肿瘤；③伴内分泌、感染性疾病。于同期选取行宫颈检查正常者37 名为对照组。年龄平均（29.51±3.71）岁，BMI 平均（22.43±1.89）kg/m2，有生产史21 例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。入试者均签署知情同意书。本研究经医院伦理协会审核批准。

1.2 方法

在入组时，两组对象均采集外周静脉血2 mL两份。应用日本TAKARA 人全血RNA 试剂盒提取全血RNA，采用微量核酸仪测定RNA 纯度与浓度。逆转录合成cDNA，置于-80℃冰箱待测。cDNA作模板进行qPCR 扩增，基于Genebank，检索并确定NLRC3 基因及目标扩增序列，应用Prism5.0 软件设计特异性引物，PCR 引物序列：NLRC3 F 为5′-CCCATACATGGATTCTCCACAA-3′，R 为5′-CCACTTCCAGATCCTACATCAAG-3′；GADPH F为5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，R 为5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。RT-PCR 反应条件：在94℃环境下预变性60 s，95℃条件下变性5 s，接着，在60℃条件下复性30 s，而后，72℃条件下延伸1 min，循环共有35 个。观察溶解曲线，结果计算采用2-ΔΔct 法，测定NLRC3mRNA 相对表达量。

采用Western blot 实验测定NLRC3 蛋白相对表达量。加入RIPA 裂解液与苯基甲烷磺酰氟（1%PMSF）均质裂解液，匀浆离心，离心转速3 000 r/min，半径13.5 cm，离心15 min，取上清液提取蛋白。应用BCA 方法测定蛋白浓度，沸水浴15 min 使蛋白变性，适量蛋白样品与10%SDS-PAGD 凝胶混合，垂直电泳后完全分离，切下含NLRC3 与内参GAPDH 的胶段，移至PVDF 膜，置于5%脱脂奶粉溶液中浸泡，室温下封闭60 min。加入20 mL 一抗稀释液（1∶1 000）与20 mL GAPDH 一抗稀释液（1∶45 000），置于4℃环境下孵育过夜，洗膜完全后，加入二抗稀释液（1∶3 000），室温下孵育60 min；洗膜完全后，利用电化学发光液采用化学发光发测定NLRC3 蛋白相对表达水平。一抗稀释液购自Abcam 公司，GAPDH 购自武汉三鹰公司，二抗稀释液购自武汉塞维尔公司。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0 分析数据资料。符合正态分布的计量资料以（）表示，两组间比较行t 检验，多组间比较采用单因素ANOVA 方差分析；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；采用Spearman 相关分析NLRC3 表达与宫颈CIN 患者病情程度的相关性；绘制受试者工作特征（ROC）曲线分析NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白表达预测CIN 发生及诊断HISL 的价值。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相对表达量比较

观察组NLRC3 mRNA 相对表达量、NLRC3 蛋白相对表达量均明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组NLRC3 mRNA、NLRC3蛋白相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of the relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein between the two groups（±s）

表1 两组NLRC3 mRNA、NLRC3蛋白相对表达量比较（±s）Table 1 Comparison of the relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein between the two groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 96 37 NLRC3 mRNA 0.046±0.024 0.098±0.027 10.236 0.000 NLRC3 蛋白2.35±0.99 3.79±0.96 7.557 0.000

2.2 不同CIN 分级NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相对表达量比较

不同CIN 分级NLRC3mRNA 相对表达量、NLRC3 蛋白相对表达量比较CIN1＞CIN2＞CIN3，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同CIN 分级NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相对表达量比较（±s）Table 2 Comparison of relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein in different CIN grades（±s）

表2 不同CIN 分级NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相对表达量比较（±s）Table 2 Comparison of relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein in different CIN grades（±s）

注：与CIN1 比较，aP＜0.05，与CIN2 比较，bP＜0.05。

CIN 分级CIN1 CIN2 CIN3 F 值P 值n 35 42 19 NLRC3 mRNA 0.071±0.017 0.037±0.013a 0.019±0.005ab 105.799 0.000 NLRC3 蛋白3.37±0.51 2.16±0.38a 0.91±0.25ab 226.163 0.000

2.3 NLRC3 表达与CIN 病情程度的相关性

Spearman 相关性分析显示，NLRC3mRNA 相对表达量与CIN 分级呈显著负相关（r=-0.863，P=0.000）、NLRC3 蛋白相对表达量与CIN 分级呈显著负相关（r=-0.894，P=0.000）。

2.4 NLRC3 表达预测CIN 发生及诊断HISL 的价值

ROC 曲线分析NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白的AUC 分别为0.916、0.832，均有较高预测价值。见表3、图2。

图2 NLRC3 mRNA、NLRC3蛋白预测CIN发生的ROC曲线Figure 2 ROC curve of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicting the occurrence of CIN

表3 NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白预测CIN 发生的ROC 分析结果Table 3 ROC analysis results of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicting the occurrence of CIN

建立ROC 曲线分析NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白诊断HISL 的价值：NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白的AUC 分别为0.684、0.762，均有一定预测价值。见表4、图3。

图3 NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白预测HISL 的ROC 曲线Figure 3 NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicted ROC curves of HISL

表4 NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白预测HISL 的ROC分析结果Table 4 ROC analysis results of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicting HISL

3 讨论

宫颈柱状上皮在各类不同高危因素诱导下发生早期病变，可使宫颈癌前病变发生风险明显上升。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）16/18 高危亚型感染，可促使癌基因异常激活，宫颈柱状上皮细胞分化障碍风险显著增加，更容易诱发宫颈原位癌［11］。对宫颈病变进行早期筛查，可为临床实施宫颈部分切除或锥形切除等方案提供指导与参考，从而有效阻断宫颈CIN 逐渐发展至宫颈癌的演变过程。临床上常采用宫颈细胞学进行常规筛查，但是该筛查方式存在一定主观差异，并且对于部分宫颈病变位置较深者，部分研究报道筛查灵敏度较低，低于70%，而漏诊率较高［12］。单纯HPV 病毒分型应用于宫颈病变筛查效果确切，然而在宫颈高级别上皮瘤变诊断上阳性符合率较低，部分可因药物使用而导致HPV 假阴性［13］。

PRRs 可激活相关炎症通路，促使机体启动防御机制。NLRs 为其主要成员之一，共有C 末端、中央NOD 与N 末端三个特征结构域，在炎症反应以及信号传导级联反应中承担着重要作用，可通过抗炎性与促炎性调节炎症反应。NLRC3 位于第16 号染色体，为胞内模式识别受体，具有高度保守显著特征。NLRC3 中央、C 末端结构域具有富含亮氨酸的重复序列，且有由6-α 螺旋束构成的CARD 域。目前，愈多研究［14-15］表明炎症反应与肿瘤发生发展联系密切，异常炎症反应或为肿瘤新生的重要标志或肿瘤主要特征。肿瘤形成早期，炎症微环境能够促使多种信号通路激活，从而驱动癌前病变进展与恶变损伤；渐而至晚期，癌细胞获得保卫机制，可从免疫监测下逃脱并避免清除。有研究［16］表明，NLRC3 参与了炎症反应过程，可负性调控炎症信号通路。NLRC3 可与ASC、caspase-5 等炎性因子在直接作用相互结合，对经典以及非经典NF-κB 信号通路进行调控，可影响肿瘤发生发展过程［17］。有研究［18］发现，NLRC3 在结肠癌中表达水平较正常组织明显降低，NLRC3是PI3K-AKT-mTOR 信号通路的抑制性感受器，可对该通路活化产生抑制作用，降低结肠癌发生风险。本研究结果与上述研究具有相似性。NLRC3或参与宫颈CIN 发生发展过程，NLRC3 低表达示CIN 病理分级差，NLRC3 可能成为预测CIN 发生以及诊断HISL 的指标。本研究进一步采用ROC曲线分析NLRC3 表达的价值发现，NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白在预测CIN 发生及诊断HISL上均有较高价值，灵敏度较高，但特异度一般。可与临床宫颈细胞学检查、HPV 病毒分型等方式联合应用，以提高宫颈CIN 早期筛查效果。

综上，NLRC3 在宫颈CIN 病变中表达水平明显降低，不同CIN 分级NLRC3 表达水平存在差异，NLRC3 表达随着CIN 分级升高而逐渐下降，二者呈显著负相关关系。并且，NLRC3 表达在预测CIN 发生及辅助诊断HISL 上具有较高价值，临床或可联合常规筛查方式，以提高宫颈CIN 早期筛查效果，从而为临床诊疗提供支持，降低宫颈癌发生率。本研究也存有样本量偏小局限，且未对NLRC3 免疫组化检测结果展开研究，今后有待进一步丰富、深入研究内容。