EB-DNA检测在重离子治疗鼻咽癌中的临床应用价值

王兴昌 陈东基 周俊年 李霞 杨婷

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种具有明显低于分布差异的恶性肿瘤，2018年估计月129 079 例NPC 新病例和72 987 例相关死亡病例中，大多数在东南亚地区，并且可能每年呈上升趋势［1］。其中我国NPC 患者占世界NPC 患者的47%，其中我国南方城市NPC 发病率普遍高于北方城市［2］。由于NPC 的肿瘤位置较深、临近的结构复杂、与颅底紧邻，因此手术无法完全切除，而放射治疗则成为了治疗NPC 患者的主要有效手段。重离子放射治疗也称为碳离子放射治疗，具有准确投射肿瘤靶区、倒转剂量分布深度、较少的氧效应等特点，是治疗NPC 的一种重要手段［3］。然而NPC 早期症状不典型、初次治疗后存在复发风险等问题，因此寻找一项NPC 早期诊断、疗效及预后情况的指标尤为重要。研究［4］表明，EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）为NPC 发病的危险因素。但EB 病毒与NPC 患者的临床疗效及预后的关系研究报道相对较少，同时目前缺乏大量的临床数据及长期随访研究。因此本研究对早期鼻咽癌患者EB-DNA 进行检测，分析其表达情况在重离子治疗鼻咽癌中的临床应用价值。报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2021年8月至2022年5月期间甘肃省武威肿瘤医院收治的42 例鼻咽癌患者资料进行分析并作为病例组，选取同期门诊体检30 名健康志愿者作为对照组。病例组：男25 例，女17 例，平均年龄（47.83±7.64）岁，临床分期为Ⅰ～Ⅱ期。纳入标准：①根据《ESMO2012 版临床实践指南：鼻咽癌，转移性非小细胞肺癌，支气管和凶险神经内分泌肿瘤，胃肠道间质瘤》［5］中关于NPC 诊断标准，及经病理活检诊断为NPC；②临床分期为Ⅰ～Ⅱ期；③治疗期间均接受重离子放射治疗；④治疗期间均接受重离子放射治疗；⑤病人及其家属均对本课题知情同意。排除标准：①存在其他部位的恶性肿瘤；②合并严重的心、肺、肾等重要器官功能障碍；③依从性差，无法配合治疗者；④临床资料不完整患者。对照组：为同期门诊体检志愿者。男16 例，女14 例，平均年龄（43.76±8.21）岁。两组性别比例、年龄等具有可比性，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 治疗方法

患者采用CT 平扫加增强扫描定位，取仰卧位于定位床上，双手置于身侧，采用头颈肩膜进行体位固定。CT 扫描自头顶至胸锁关节下方扫描，层厚1.5 mm，并与治疗体位下的头颈部增强CT 及MRI 图像相融合，必要时与PET/CT 进行图像融合。由具有丰富经验的临床医师在定位CT 上勾画GTV、CTV，根据我院实测摆位误差进行外扩3 mm 形成PTV。同时勾画视神经、大脑颞叶、视交叉、内耳、颞颌关节、脊髓、脑干、腮腺等临近危及器官。处方剂量和危及器官限量均采用国内外发表的相关重离子文章及我院SOP 文件规定剂量。采用中国近代物理研究所自主开发的HIMM 重离子加速器及Ci-Plan 重离子治疗计划系统进行治疗计划制定计划，经医师、物理师双方审核通过后，采用HIMM 重离子加速器进行重离子治疗。

1.3 血浆EB-DNA 检测

采集对照组及病例组治疗前、治疗1 个月后的静脉血3 mL，3 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，取上层血浆，采用荧光定量聚合酶链反应对EB-DNA 进行检测，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。EB-DNA＞5×102copy·mL-1为检测阳性。试剂盒产自美国eBioscience 公司。

1.4 观察指标

统计对照组治疗前的EB-DNA 检测阳性率；以鼻咽部活检诊断结果作为金标准，绘制EB-DNA 表达对NPC 的诊断ROC 曲线，统计诊断效能；以治疗1 个月后临床疗效为近期疗效，对患者进行EB-DNA 检测，检测阳性患者为阳性组，检测阴性患者为阴性组，比较两组的近期疗效准。

近期疗效评价标准：依据文献［6］中评价标准进行评价，其中分为完全缓解（complete remission，CR）、部分缓解（partial mitigation，PR）、病情稳定（stable disease，SD）以及病情进展（progressive disease，PD）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行统计分析；计量资料符合正态分布采用（）表示，比较用t检验，非正态分布数据用M（P25，P75）表示，比较采用Mann-Whitney U 检验；计数资料用n（%）表示，比较用Kruskal Wallis 检验；ROC 曲线检测EB-DNA 表达对NPC 的诊断效能；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组EB-DNA 拷贝量及阳性检出率比较

病例组血浆EB-DNA 拷贝量显著高于对照组，EB-DNA 阳性检出率低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组EB-DNA 拷贝量及阳性检出率比较［M（P25，P75），n（%）］Table 1 Comparison of EB-DNA copy numbers and positive detection rates between the two groups［M（P25，P75），n（%）］

2.2 血浆EB-DNA 检测对NPC 的诊断效能分析

绘制血浆EB-DNA 表达对NPC 诊断的ROC曲线，结果显示，曲线下面积（area under the cure，AUC）为0.963［P＜0.001，95%CI（0.916～1.000）］。见图1。其对应的敏感度、特异度分别为0.929、0.933。

图1 血浆EB-DNA 检测对NPC 的诊断ROC 曲线图Figure 1 ROC plot of plasma EB-DNA testing for the diagnosis of NPC

2.3 治疗1 个月后患者EB-DNA 检测结果与近期疗效比较

Kruskal Wallis 检验结果显示，治疗一个月后EB-DNA 检测阴性患者近期疗效显著优于EB-DNA 检测阳性患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 治疗1 个月后患者EB-DNA 检测结果与近期疗效比较［n（%）］Table 2 Comparison of EB-DNA test results between patients after 1 month of treatment and recent outcomes［n（%）］

3 讨论

NPC 是一类高发的头颈部恶性肿瘤，其临床表现较为复杂，包括鼻出血、视力障碍甚至脑神经损伤等［7］，其多发于鼻咽顶壁、咽引窝等位置，目前全球范围内的发病人数已大于8 万，而病死人数接近5 万［8］，具有明显的地理分布特点，在东亚和东南亚尤为流行［9］。NPC 病人对放疗、化疗均具有较高的敏感性，若患者在疾病早期及早被发现且积极接受治疗，治疗后5年生存率可达到80%以上，但仍有部分患者进展至中后期或转移，其预后及生存情况不甚理想。重离子放射治疗即为碳素离子放射治疗，该治疗方案具有较高的癌细胞致死率，且可实现单+次照射剂量高、照射次数少的可能性，进一步增强了疗效。然而，NPC 肿瘤位置复杂、放疗照射范围不足或存在放疗不敏感细胞等原因可能造成治疗后局部复发或转移。因此，NPC 发病早期一定的隐匿性、治疗后可能复发转移等情况下，寻找NPC 的诊疗有效检测指标尤为重要。体格检查、计算机断层扫面、MRI、纤维鼻咽镜等检测手段是常用的NPC 诊断技术，然而其费用昂贵，普适性较差。

1988年某学者在NPC 患者血浆中发现EB 病毒的DNA，并认为患者血浆EB-DNA 水平动态变化可作为NPV 的诊断辅助指标［10］。同时，研究［11］发现，EB-DNA 的表达检测可用于NPC 患者的预后评估中。EB 病毒是1964年被Epstein 与Barr 两位学者发现的，属于孢疹病毒科R 亚科，可感染灵长类动物的B 淋巴细胞。已有大量的研究表明，部分个体感染EB 病毒后，可转化形成肿瘤，如NPC、淋巴癌等，EB 病毒是NPC 的一个诱发因子。已有研究表明，EB-DNA 在NPC 的诊断、疗效评估、预后评估等方面存在重要的意义［12］。但目前尚未有充足的临床数据以及长期随访数据的相关研究支持该结论，因此本课题对42 例NPC 患者EB-DNA 进行检测，分析NPC 患者EB-DNA 对疾病的诊断、近远期疗效及其预后的评估效能，以EB-DNA 检测在重离子治疗NPC 中的临床应用价值。

为探讨血浆EB-DNA 载量对早期NPC 的诊断效能，本研究选取了42 例早期（临床分期为Ⅰ～Ⅱ期）NPC 患者作为研究对象，与同期体检的健康人群比较。结果显示，病例组EB-DNA 阳性检出率显著高于对照组，与Hui 等［13］研究中NPC 患者EB-DNA 阳性检出率96%、健康人群EB-DNA 阳性检出率检出率7%结果基本一致。进一步进行诊断效能分析，结果显示，EB-DNA 表达对NPC 的诊断具有较高的效能。两项结果提示，NPC 患者血浆EB-DNA 载量与健康人群存在显著的差异，同时其对NPV 早期诊断筛查均有显著的应用价值。研究［14］表明，EB 病毒可在B 淋巴细胞内进行增殖，并以环状DNA 的形式在细胞质中游离并整合，整合至染色体内，NPC 细胞死亡后，染色体内的EB 病毒片段则被释放入血中，血浆EB-DNA 载量随之上升。

本课题在研究对象治疗1 个月后再进行EB-DNA 检测，并对近期疗效进行评估，结果显示，EB-DNA 检测阴性患者CR 的比例显著高于EB-DNA 检测阳性患者。结果表明EB-DNA 检测阳性患者预后较差，与报道研究［15］结果一致，提示EB-DNA 检测阳性对重离子治疗NPC 的近、远期疗效具有一定的预测性。患者血浆中EB-DNA 主要来源于NPC 肿瘤灶，血浆中EB-DNA 载量反应了人体肿瘤的符合，因此EB-DNA 检测阳性表明可能存在肿瘤遗留或存在复发的风险。

综上，EB-DNA 检测可作为NPC 早期诊断与重离子放射治疗疗效和预后的参考指标。然而本研究中选取病例有限，经分析了EB-DNA 的表达情况与治疗近远期疗效的关系，后续仍需收集更多的病例样本，进一步分析患者血浆中EB-DNA载量在重离子治疗NPC 的应用。