基于网络药理学及分子对接技术探索清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎的机制研究

朱万青， 李伟伟， 李娟

0～14岁儿童呼吸系统疾病占儿科门诊就诊总数的1/4[1]。近十年来，儿童支气管-肺系统病变的发病率增加了3.6倍，主要是以上、下呼吸道的急性和复发性炎症性疾病为主[2-3]。急性支气管炎的发病率也随着增高，这使儿童门诊治疗变得非常复杂[4-6]。许多患者需要住院治疗，对孩子和父母都造成压力[7-9]。支气管炎症不受控制且反复发作的急性支气管炎最终会导致肺功能下降，进而可能导致哮喘的发生[2,10-12]。治疗上多以抗感染、化痰药及支气管扩张类药物为主，但疾病易反复发作，其临床疗效往往不理想。小儿由于“脏腑娇嫩，形气未充”的生理特点决定了小儿肺气常常不足，故而临床上治疗小儿支气管炎往往采用清补肺气的治疗原则，且疗效显著。

清宣止咳颗粒是根据张珍玉教授多年临床观察研究而研发的中成药，该方是由桑叶、陈皮、白芍、杏仁、紫菀、枳壳、薄荷、甘草、桔梗组成。既往研究表明，清宣止咳颗粒通过减少咳嗽模型大鼠血清中炎症因子含量，增强机体的免疫功能，抑制气道中炎症因子的产生，从而可以改善咳嗽的症状[13]；清宣止咳颗粒可以有效减少咳嗽型小鼠模型肺部充血、炎细胞浸润等病变的发生，进而缓解咳嗽、咳痰的症状[14]。在临床诊疗的过程中发现，使用清宣止咳颗粒联合治疗小儿急性支气管炎，可有效的缩短其病程，明显改善患儿咳嗽、咳痰症状，临床疗效满意[15]。

图1 小儿支气管炎差异表达基因的热图

近年来，微阵列技术越来越多地用于生命科学研究，中药成分与疾病的关联性、基因的生物信息学数据挖掘已广泛用于差异表达分析。本研究通过运用生物信息学、网络药理学和分子对接的现代科学技术，从分子诊断到分子分类，多层次分析清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎的可能潜在机制。

1 药物活性成分筛选法

清宣止咳颗粒活性成分和潜在靶点分别以桑叶、陈皮、白芍、杏仁、紫菀、枳壳、薄荷、甘草、桔梗为关键词，以类药性指数≥0.18[16]以及口服生物利用度≥30%[17]作为筛选条件，对应的药效成分信息在中药系统药理数据分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)数据库中采集。此外，在数据库Ingredients中获得筛选得到的清宣止咳颗粒药物有效化学活性成分对应的靶点蛋白，并进一步在Related Targets中获得蛋白靶点对应的疾病靶点，再通过Perl软件筛选出无对应靶点成分，将重复靶点排除。

2 疾病核心靶点筛选

2.1 微阵列芯片下载 以“Syncytial Virus Genotypes”为关键词在NCBI GEO数据库搜索微阵列数据集，本研究下载了GSE103842数据集，本数据集描述了5个非连续呼吸季节中呼吸道合胞病毒菌株的遗传变异性，并评估了呼吸道合胞病毒亚型、基因型和病毒量对临床疾病严重程度的作用。

2.2 数据处理和差异表达基因分析 使用Perl软件将GSE103842数据集由探针的名称转化为基因名，例如，当多个探针名称与同一基因名相对应时，取该基因表达值的平均值；使用VennDiagram包对GSE103842数据集进行整合，删除重复的、无效的基因名称，筛选出小儿支气管炎的靶标基因。我们再运用R软件LIMMA包对筛选出来的小儿支气管炎基因表达矩阵进行归一化处理，获取小儿支气管炎基因的表达值，再以adjustedP<0.05和|log2 FC(fold change)|≥1作为筛选标准，筛选出数据集中小儿支气管炎的疾病基因。

2.3 绘制韦恩图，获取共有靶点 使用R软件中VennDiagram包绘制韦恩图，筛选出清宣止咳颗粒药物靶点预测和小儿支气管炎的疾病基因集的共有靶点。

2.4 差异表达基因(differential expressed gene，DEG)的功能富集分析 基因本体(gene ontology，GO)提供了一个框架来描述所有生物体中基因产物的功能，并识别高通量基因组的特征生物学特性或转录组数据[18]。GO注释分为三个部分：生物过程、细胞构成和分子功能。基因组数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)向具有高阶功能信息的关键数据分配DEG集的特定路径，可用于功能解释和基因组信息的实际应用[19]。利用基因功能分析的注释、可视化和综合发现数据库(https：//david.ncifcrf.gov)。David提供的分析模块将数据转换为加快分析基因组级数据集合的生物学意义[20]。为了揭示筛选的DEG在小儿支气管炎进展中的生物学意义，我们使用DAVID对来自Venn包的DEG进行GO功能和KEGG通路富集分析，错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.05被认为具有统计学意义。

2.5 DEGs的蛋白互作网络图(protein-protein interaction networks，PPI)分析，筛选核心靶点 蛋白质之间的相互作用对于理解肿瘤的代谢和分子机制至关重要。新版String 10.0数据库覆盖了2 000多种生物，几乎是之前版本的两倍[21]。以通过使用String 10.0数据平台分析DEG PPI图谱。在Cytoscape中导入分析的结果中导入插件使用Cytohubba已经下载安装。以最大团中心性(maximal clique centrality，MCC)算法的前十名作为标准，筛选出基因表达网络中具有高连通性的Hub基因。

3 分子对接

“中药-活性成分-靶标”网络图中度数最高的11种活性成分与KEGG核心蛋白进行分子对接。化合物的结构来自PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，蛋白质结构来自PDB数据库(http://www.rcsb.org)。应用MOE(molecule operating environment)软件对蛋白质进行对接，将受体蛋白设置为半柔性对接，选择LondondG算法，其余设置默认参数。并使用MOE软件对分子对接分析的结果进行可视化，以获得2D和3D图像。

4 结果

4.1 清宣止咳颗粒组成和目标筛选结果 经筛选，目前共搜集到清宣止咳颗粒有效药物活性成分81个,其中桑叶9个、薄荷1个、桔梗1个、紫菀1个、白芍1个、陈皮1个、甘草56个，多种药物共有活性成分11个。将TCMSP数据库中发现的蛋白靶点输入到uniport数据库中，共获得基因靶点266个，相应的药物靶点25个。

4.2 微阵列芯片下载及获取疾病基因集 通过GEO数据库以检索式搜索到有关小儿支气管炎的数据集GSE103842数据集总共收集了小儿支气管炎患者和健康对照者的全血样本，全血表达的基因使用微阵列进行检测。本研究对GSE10384数据集进行校正和归一化后，获取小儿支气管炎的基因集，基因集中共有1 732个基因，见图1(插页1)。并保存为“disease.txt”文本文件。

4.3 获取药物和疾病的共有靶标结果 采用EXCEL表将清宣止咳颗粒中发现的目标与小儿支气管炎进行合并以明确清宣止咳颗粒与小儿支气管炎的关系，最终得到24个交叉目标，见图2，然后构建韦恩图来可视化数据(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)。

图2 清宣止咳颗粒药物靶点与小儿支气管炎相关发病机制靶点韦恩图

4.4 构建“中药-有效成分-靶向基因”网络 利用EXCEL整合中药靶点与疾病靶点的交叉点，得到24个靶基因，导入Cytoscape 3.7.2构建中药-活性成分-靶点网络。由此得到106个节点，发现812个交互关系。“中药-有效成分-靶基因”网络见图3，根据靶点蛋白与药物的关系构建“药物-靶点-化学成分”分析发现，涉及到的疾病靶点根据度值选择前十的基因包括苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine kinase 1，AKT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG)、信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)、醛酮还原酶家族1成员B1(aldo-keto reductase family 1 member B1，AKR1B1)、CD163细胞(cluster of differentiation 163，CD163)、螺旋环螺旋结构区域内扩散激酶(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase,CHUK)、丝裂原活化蛋白激酶14(recombinant mitogen activated protein kinase 14，MAPK14)、花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)。为了能够更加直观地探析清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎的作用机制，本研究还对“药物-成分-疾病靶点”进行网络构建，经分析可知清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎的关键化学成分为豆甾醇、槲皮素、刺槐素、山奈酚、菜豆素、甘草黄酮、甘草查尔酮乙、异鼠李素、木犀草素、柚皮素，见图3。

4.5 富集过程分析结果 富集分析结果显示在GO功能富集中，生物过程中，主要参与肽的反应、脂质定位的调节、脂蛋白颗粒的反应、细胞对脂蛋白颗粒刺激的反应、炎症反应的细胞因子产生。在细胞构成中主要富集于管腔分泌颗粒、囊腔、转录调节复合物等，主要与核受体活性结合，配位体在分子功能中活化转录因子活性结合，RNA聚合酶Ⅱ在DNA中特异结合。蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性相关，脱氧核糖核酸结合转录因子结合是蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性相关见图4。此外，在KEGG通路富集结果中，小儿支气管炎可能与Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis、Acute myeloid leukemia、Adipocytokine signaling pathway信号通路等密切相关，见图5。

图3 清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎的“中药-活性成分-靶点”网络

X轴代表被GO富集的基因的数目，Y轴代表GO功能。渐变色表示矫正后的P值。P<0.05作为显著富集的阈值

X轴代表被KEGG富集的基因的数目，Y轴代表KEGG功能。渐变色表示矫正后的P值。P<0.05作为显著富集的阈值

4.6 核心基因筛选 将清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎潜在作用靶点导入STRING数据库进行在线PPI分析，交互阈值设置为“0.4”以隐藏附加型基因目标。图中的“边”代表交叉基因之间的关联程度，表示关联程度。因此，关联越大，节点代表交叉基因的机会就越大。结果如图6所示：度值最高的前30个靶点绘制成核心基因柱状图，涉及到的疾病靶点前十的包括AKT1、PPARG、STAT3、ABCA1、AHR、AKR1B1、CD163、CHUK、MAPK14、ALOX5。

4.7 核心作用靶点筛选进行分子对接 小儿支气管炎的发病机制可能与Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis、Acute myeloid leukemia、Adipocytokine signaling pathway信号通路等免疫炎症相关,根据KEGG信号通路富集分析结果，如表1。

图6 清宣止咳颗粒药物靶点与小儿支气管炎疾病蛋白质相互作用图

表1 核心靶点基因通路富集表

分别选取Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis,并结合网络药理学预测的选取的3条信号通路制作韦恩图，如图7所示，选取3条通路的共同的作用靶点作为关键靶蛋白,MAPK14、STAT3、CHUK为3条通路的共同的作用靶点,并与清宣止咳颗粒药物成分豆甾醇、槲皮素、刺槐素、山奈酚、菜豆素、甘草黄酮、甘草查尔酮乙、异鼠李素、木犀草素、柚皮素进行分子对接。

4.8 分子对接结果 用MOE中的Dock模块进行分子对接，选择基于蛋白和配体间相互作用能的打分函数ASE，分别得到每个化合物与受体的对接打分，打分越低，配体与受体结合越稳定，结果见表2，总体来说，疾病核心靶点与化合物结合相对稳定，其中S值小于-7.0的有CHUK与Acacetin；STAT3与Acacetin；MAPK14与isorhamnetin。主要活性成分和核心靶点之间的结合情况与预测关系相符。现将结合能小于-7对接结果进行可视化展示，见图8。

表2 核心靶点与药物共同化学成分结合对接分数表能(kJ/mol)

图7 Lipid and atherosclerosis、Th17 cell differentiation、Toxoplasmosis韦恩图

3 讨论

急性支气管炎是由生物、物理、化学刺激或过敏、感染等因素引起的气管支气管黏膜的急性炎症[22]，故治疗多以对症治疗为主。但对于反复发作，体质较弱的婴幼儿，中医药治疗疗效显著。急性支气管炎属于中医“咳嗽”的范畴，小儿咳嗽常急性起病，由于小儿肌肤薄嫩、易感外邪，病情易反复。清宣止咳颗粒是由张珍玉教授在民间验方的基础上研制而成的纯中药制剂，方中桑叶甘苦性凉，薄荷辛凉，疏风散热共为君药；杏仁、枳壳苦降，桔梗辛散，祛咳止痰共为臣药；紫菀味苦温而不热，白芍味酸敛阴，陈皮苦温行滞化痰共为佐药；甘草调和诸药为使药。全方药性温和，不寒不热，药物组成以清宣为主，不伤及肺脾，对小儿常见的发热、咳嗽、咽痛咽痒、鼻塞流涕均有较好疗效。研究表明，清宣止咳颗粒具有镇咳、祛痰、抗炎的药理作用[23]。然而清宣

图8 分子对接模式图

止咳颗粒能够发挥治疗作用的具体细胞分子作用机制仍不明确。故本研究使用生物信息学、网络药理学和分子对接的方法研究清宣止咳颗粒和小儿支气管炎的蛋白基因、有效化学成分和相关的生物过程，以探索清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎的潜在机制。

通过PPI网络分析可知，AKT1、PPARG、STAT3、ABCA1、AHR、AKR1B1、CD163、CHUK、MAPK14、ALOX5这10种基因靶点超过所有度值的2倍中位数，这些基因靶点在网络中起关键作用，提示清宣止咳颗粒活性成分与这些疾病靶点具有较高的结合活性。STAT3作用于哮喘越来越受到人们的关注，它参与了信号传导和转录活蛋白的研究工作。STAT3能通过介导白细胞介素-6的免疫反应来调控Th17细胞的分化。它可以作为转录因子启动靶基因转录，对炎性基因的蛋白质进行编码，使蛋白质释放出来，从而使炎性反应扩增。这是炎症基因表达在哮喘发病机制中的基础[24-25]。

前列腺素内过氧化物合酶MAPK又叫做环氧合酶，它是抗炎药物的重要靶点，能减少炎症因子的产生从而起到抗炎、解热作用[26]。研究发现，通过调节炎症介质，MAPK14能够参与到调节炎症反应的过程中来[27]。在CHUK基因编码的复合物抑制蛋白激酶-α(IκB kinase-α，IKKα)，是核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路的一种必要调节器，而NF-κB信号通路被发现是支气管炎过程中的一个重要的炎症介质[28]。

通过GO富集分析发现，清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎涉及的生物过程主要参与肽的反应、脂质定位的调节、脂蛋白颗粒的反应、细胞对脂蛋白颗粒刺激的反应、炎症反应的细胞因子产生。在细胞构成中主要富集于管腔分泌颗粒、囊腔、转录调节复合物等，主要与核受体活性结合，配位体在分子功能中活化转录因子活性结合，RNA聚合酶Ⅱ在DNA中特异结合。蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性相关，脱氧核糖核酸结合转录因子结合(deoxylnuclesacid)与蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性相关。

通过KEGG富集分析发现，小儿支气管炎涉及的清宣止咳颗粒治疗信号通路主要与Th17信号通路、NF-κB信号通路、晚期糖基化产物(advanced glycation end-products，AGE)-晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)信号通路即(AGE-RAGE)信号通路有关。

由于Th1/Th2不平衡导致的炎性细胞因子网络不平衡在很多疾病的发生和发展中起着举足轻重的作用[29]。经过Th17细胞的继鉴定，Th17细胞及其细胞因子的不均衡已成为各种自身免疫性疾病及其他疾病的理论基础。Th17和Treg细胞是Th1和Th2免疫平衡的一个重要补充。Th1/Th2的不平衡与其本身免疫疾病有着密切的关系[30-31]。

Th17主要是通过白细胞介素-22、白细胞介素-17等细胞因子的分泌，对防御细胞外细菌感染、介导本身免疫性病症具有重要意义。其中，分子最多的是白细胞介素-17。该系统由诱导炎性细胞的局部浸润，例如白细胞介素-22，导致组织破坏。在机体免疫系统中，Treg细胞是负调节的。他们不但对不适当的免疫反应起到抑制作用，而且在免疫反应的范围、反应程度和持续的免疫反应方面也扮演着重要角色，白细胞介素-6、白细胞介素-23和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)激活STAT3可诱导Th17分化和白细胞介素-17细胞因子产生。此外，STAT3还与维甲酸相关孤核受体γt(retinoid-related orphan receptor gamma t，RoRγt)协同对Th17细胞及其功能进行了稳定[32-33]。激活STAT3是白细胞介素-6调节Th17分化所必需的，通过提高RoRγt和RoRα的表达，STAT3能够促进Th17细胞亚群的分化。并在其增殖过程中起着重要的作用，表达细胞因子。

MAPK14、STAT3、CHUK是根据KEGG富集分析出的与AGE-RAGE、NF-κB信号通路相关的靶点。AGE-RAGE信号通路参与了支气管上皮细胞TGF-1和NF-2分泌的尼古丁调控[34]。对支气管炎发生、发展进行调控；在调节炎症的过程中，NF-κB是一个关键的因素。转录因子NF-κB在全身性炎症中进行了研究，并已在支气管患者中发现。在灭活状态下，NF-κB位于胞质溶胶中并与抑制蛋白kappa B(inhibitor of NF-κB，IκB)复合。IκB β仅被某些刺激物磷酸化，包括脂多糖和白细胞介素-1β，而IκB α磷酸化由大多数NF-κB激活剂触发。在呼吸道上皮受多种细胞外刺激作用的受体时，即激活IκB激酶(IκB kinase，IKK)[35]。因此，NF-κB通路产生的细胞因子在炎症细胞迁移中发挥重要作用，并在小儿支气管炎发展过程中加强氧化应激，进一步加重病情。

分子对接结果显示，清宣止咳颗粒中的活性成分槲皮素、刺槐素、异鼠李素、山奈酚与蛋白质有较强的结合性。槲皮素具有抗炎、抗氧化作用，既往研究证实，槲皮素则可通过减少氧化应激、调控基质金属蛋白酶-9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)和MMP-12的表达来防止呼吸道炎症的进展。槲皮素还可通过多种途径来抑制肺炎链球菌的感染[36]。刘萍等[37]研究表明槲皮素能保护支气管上皮细胞的作用机制可能与NF-κB信号通路相关。有研究表明山奈酚对铜绿假单胞菌、幽门螺旋杆菌等致病菌有较好的治疗作用，同时对登革热病毒及脑炎病毒有抑制作用，这与它能刺激NF-κB信号通路，增加白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子的表达下调白细胞介素-6有关[38-41]。研究还显示异鼠李素对金黄色葡萄球菌及链球菌有显著的抑制作用[42]。刺槐素是一种天然黄酮类化合物,研究表明，刺槐素可通过抑制Srt A活性,降低金黄色葡萄球菌毒力，提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率,降低金黄色葡萄球菌感染小鼠肾脓肿模型中肾脏脓肿程度[43]。

综上所述，清宣止咳颗粒治疗小儿支气管炎主要的活性成分为槲皮素、异鼠李素、刺槐素、山奈酚等，通过调控Th17信号通路、NF-κB信号通路、AGE-RAGE信号通路等炎症信号通路，作用于MAPK14、STAT3、CHUK靶点，从而起到抗炎、保护支气管平滑肌的作用，改善支气管炎的临床症状。

4 结论

总之，本研究证明了基于网络药理学方法治疗小儿支气管炎的潜在清宣止咳颗粒效应机制。我们揭示了槲皮素、刺槐素、异鼠李素和山奈酚通过影响STAT3、MAPK14、CHUK等因子在小儿支气管炎中起关键作用。此外，我们的分子对接研究还表明，清宣止咳颗粒的主要活性成分(槲皮素、刺槐素、异鼠李素、山奈酚)可以与STAT3、MAPK14、CHUK很好地对接，为进一步研究提供了重要依据。然而，这项研究也有一定的局限性，因为药理学和临床研究仍需要进一步验证我们的发现。