冠突散囊菌茶对高糖、高脂大鼠的血糖和血脂相关因素的影响

李兆龙，陈常颂，孔祥瑞，李世荣

(1.福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院 茶叶研究所，福建 福州 350013；3.泉州华惠生物科技有限公司，福建 泉州 362407)

伴随着国民经济的发展，人民生活水平的提高，民众在日常生活中高脂、高糖和高蛋白饮食增加，我国近几年高血糖、高血脂和高血压的患者呈直线上升。现有的降糖、降脂和降压药物需要长期服用，且大多有一定不良反应，给人民的生活负担和身心健康带来较多的影响[1-4]。

已有研究表明，作为无酒精饮料的茶具有抗脂质过氧化、清除自由基、降低高血脂和高血糖症、减少心脑血管疾病等作用，其中研究较多的有乌龙茶、绿茶、黑茶及其相关的活性成分，特别有研究报道茯砖黑茶对降糖、降脂功效明显[5-11]。茯砖黑茶以安化黑毛茶为原料，经加工制成块状成品，经一定时间的存储，茶内砖绽放 “金花”(冠突散囊菌)丰度是近几年砖茶制作受热捧的原因之一[12]。金花是一种真菌，学名冠突散囊菌，其寄生在茶叶中，可分泌一些酶，催化茶叶中的蛋白质分解为有益的小肽、促进淀粉转化为单糖，催化多酚类化合物氧化，转化成对人体有益的物质。此外，有报道称茯砖黑茶中提取的茯茶素有显著降脂减肥和降糖功效[13-15]。

本研究以冠突散囊菌茶粉为原料，选用 SD 大鼠为试验动物，通过大鼠高糖和高脂模型，探讨冠突散囊菌茶粉是否具有降脂减肥和降糖功效，以期为茶类新产品的奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及茶叶冠突散囊菌FJ201715株，由本实验室分离鉴定及保存。铁观音茶叶，购自安溪县有机茶有限公司(生产日期2018年5月15日)。

1.2 实验动物雄性健康3周龄 SD 大鼠100只，体质量为 55～58 g，购自福建省吴氏实验动物有限公司，许可证号：FJAE(闽)2020-0121。所有动物试验经福建师范大学南方生物医学研究中心实验研究伦理委员会批准[批准号：伦审科 2020 第(35)号]；在无特定病原体环境下饲养，自由饮水和进食基础饲料(表1)，室温 25℃，湿度25%。

表1 大鼠日粮组成 %

1.3 试剂甲醇、三氯甲烷、乙醇、氯仿、异丙醇和甲酸均购自国药化学试剂公司；TRIzol购自美国Invirtrogen公司,反转录试剂盒及PCR反应试剂盒购自天根生化科技有限公司，荧光定量试剂盒和DEPC水均购自Sigma公司。胆固醇、胆盐、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL-C)测定试剂盒(迈瑞生物公司提供)；其他试剂均为国产分析纯。

1.4 冠突散囊菌茶粉的制备取100 mL的冠突散囊菌，加入900 mL的麦芽汁培养基，移至恒温培养箱，28℃、250 r/min恒温培养(24 h左右)，待菌液的浓度达到1×108CFU/mL。然后装入无菌喷壶，按体积1∶40将其喷洒接种至100℃烘培(灭菌)2 h后室温冷却的有机铁观音成茶(1 500 g)。喷洒接种菌的茶叶放至无菌恒温培养箱，28℃、150 r/min，湿度40%，培养96 h，待菌均匀生长后，应用血球计数法测算孢子囊数达1×107个/mL后，取长孢子囊的茶叶，100℃烘干2 h,经碾磨粗滤、精滤制成茶粉(规格按200目)备用。

1.5 高糖、高脂大鼠模型的制备3周龄雄性SD大鼠，适应性饲养5 d后，取体质量为67～68 g雄性SD大鼠90只，每组15只，随机分为6组，其中常规饲料组(对照组)和高糖、高脂饲料组(模型组)在无特定病原体环境下饲养，室温 25℃，湿度25%饲养4周，然后每组抽检2只空腹血糖和血脂情况，以验证高糖、高脂模型制备。

1.6 高糖、高脂大鼠的分组及干预取1.5制备的高糖、高脂模型大鼠72只，按造模时6组，每组剔除造模时采血验证的大鼠，按每组12只进行干预试验，其中5组高糖、高脂模型组大鼠，每天分别以20，40，60，80，100 mg/kg的剂量灌胃冠突散囊菌茶粉悬液，空白对照组则灌胃等量5 mL蒸馏水，喂养 4 周，每周定时测体质量。每周每组定时选取2只，禁食12 h，尾静脉采血1 mL,4℃、2 200 r/min离心10 min，分离出血清，测定血清 TC、TG、HDL-C 及LDL水平。4周试验结束时，各组统一禁食12 h，称量各组的体质量，然后眼眶下动脉取血5 mL，4℃、2 200 r/min 离心10 min，分离出血清，测定血清 TC、TG、HDL-C、LDL及空腹血糖水平，再解剖大鼠，取试验大鼠的十二指肠、回肠、结肠和盲肠各1 cm，用蒸馏水清理肠道食物残渣，然后用生理盐水漂洗，再分装至对应的离心管后立即浸入液氮速冻，并转移至-80℃保存备用。

1.7 生化指标的检测血清 TC、TG、HDL-C、LDL、空腹血糖按试剂盒说明书进行测定。

1.8 引物设计与合成根据GenBank公布的相应的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物(表2)，由福州博尚生物科技有限公司合成。其中胰高血糖素原基因(proglucagon gene，PLG)的引物设计采用葡萄糖转运体2(GLUT-2)在GenBank中的特异性序列进行设计与合成。

表2 各基因引物信息

1.9 RNA的提取及实时定量PCR将各段肠组织和液氮一起研成粉末，转到EP管，加入1 mL TRIzol溶液，混匀室温放置6 min后，4℃、12 000×g离心10 min，取上清至另一新EP管，加入0.2 mL氯仿，充分振荡混匀，室温放置5 min，4℃、12 000×g离心10 min，取上层水相加入等量异丙醇，混匀后离心10 min，弃上清，加入75%乙醇重悬沉淀，12 000×g离心10 min，弃液体，放置超净台风干，然后加入50 mL DEPC水溶解RNA，分装，-80℃保存备用。

1.10 肝组织切片病理学观察选取大鼠肝脏0.6 g，用10%甲醛固定，加入石蜡进行切片包埋，再HE染色，于显微镜下观察并记录肝脏的组织病理学变化。

2 结果

2.1 冠突散囊菌茶粉经过28℃ 96 h的恒温培养，冠突散囊菌(金花)遍布茶叶的叶片，每片叶片孢子囊数量为500～1 000个，呈现金黄色(图1)。将该茶叶100℃烘干2 h后，200目的超微粉碎，制成冠突散囊菌茶粉室温密封备用。

图1 冠突散囊菌在茶叶中生长情况

2.2 高糖、高脂日粮对体质量和血糖、血脂的影响结果显示，经 4 周高糖和高脂饲料喂养，模型组大鼠的体质量比正常日粮对照组的体质量明显增高(表3)；模型组大鼠的血清 TC、TG 也显著高于空白对照组，空腹血糖值明显高于对照组，证实高糖、高脂大鼠动物模型建成(表4)。

表3 高糖、高脂日粮对大鼠体质量的影响

表4 高糖、高脂大鼠血清的血糖和血脂 mmol/L

2.3 冠突散囊菌茶对高糖、高脂大鼠的体质量、血糖和血脂的影响经过4周持续的冠突散囊灌胃菌茶粉悬液，模型组大鼠的体质量增长幅度下调，至试验结束时和对照组体质量无明显差异，整个模型组体质量增长明显减缓，与对照组相比差异不显著(表5)。与高糖、高脂的模型组相比较，冠突散囊灌胃组的大鼠血清 TC、TG、LDL和空腹血糖值显著降低(P<0.05)，其中以灌胃100 mg组大鼠血清的 TC、TG、LDL和空腹血糖值最低。此外，冠突散囊灌胃组的大鼠血清的HDL-C出现明显下调，其中以灌胃100 mg组大鼠下调最为明显(P<0.01)(表6)。

表5 冠突散囊菌茶对高糖、高脂大鼠体质量的影响

表6 冠突散囊菌茶对高糖、高脂大鼠血脂和血糖的影响 mmol/L

2.4 冠突散囊菌茶大鼠的肝脏组织形态学变化的影响通过大鼠的肝脏病理组织切片(图2)观察可见，正常日粮饲喂组大鼠的肝脏组织结构完整，无明显的脂肪变性。而高糖、高脂模型组大鼠的肝细胞结构不完整(图2B)，呈现大面积的空泡状脂肪变性。与高糖、高脂模型组大鼠相比，灌胃冠突散囊菌茶粉60，100 mg组的肝脏组织结构完整，肝细胞脂肪变性不明显，肝细胞空洞现象少。

A.正常对照组；B.高糖、高脂模型组；C.60 mg冠突散囊菌茶灌胃组；D.100 mg冠突散囊菌茶灌胃组

2.5 PLG在肠道的表达量由图3可知，5组不同剂量的冠突散囊菌茶灌胃组，其空肠、结肠和盲肠的PLG相对mRNA均有明显上调(P<0.05)，其中高剂量(80，100 mg)冠突散囊菌茶灌胃组在空肠中的PLG mRNA上调最显著(P<0.01)。十二指肠中，只有高剂量(80，100 mg)的PLG mRNA显著上调，其他和对照组差异不显著(P>0.05)。

A.空肠；B.结肠；C.盲肠；D.十二指肠；*表示P<0.05(与对照比较)；0表示与其他组比较差异显著

2.6 GLUT-2的表达量由图4可知，5组不同剂量的冠突散囊菌茶灌胃组，其空肠、结肠和盲肠的GLUT-2相对mRNA均有下调趋势，其中高剂量(100 mg)冠突散囊菌茶灌胃组在60 d后，其各肠道的GLUT-2 mRNA下调明显(P<0.05)。而盲肠和空肠在80 mg冠突散囊菌茶灌胃组也出现GLUT-2明显下调(P<0.05)。

A.盲肠；B.空肠；C.结肠；D.十二指肠

3 讨论

本研究结果表明，冠突散囊菌茶明显下调了高糖、高脂大鼠的空腹血糖，也降低了高糖、高脂大鼠血清中TC、TG的含量。此外，冠突散囊菌茶对高糖、高脂大鼠血清中的HDL-C 水平有明显的上调作用。这一结果说明冠突散囊菌茶对试验大鼠具有辅助降糖和降血脂功能。

冠突散囊菌作为真菌的一种，多见于茯茶中生长。有研究证明，其寄生在茶叶表面，分泌一定量的胞外多糖和部分的茯茶素类化合物，具有显著的降脂减肥和降糖功效[12-14]。而茶叶又含有儿茶素、咖啡因和叶酸等成分，可以促进脂肪分解，降低血液黏稠度，对降低血脂有一定作用[5-11]。本试验结合两者共同的功能作用，将冠突散囊菌接种至茶叶表面，通过短时间和大剂量的接种，并为菌群生长提供适宜条件等，推动冠突散囊菌在茶叶表面的快速生长，以研究两者结合在降糖降脂的功效，试验结果表明其对降糖和降脂有积极的作用。但对两者结合是否有更多的叠加作用以及相关机理，还有待进一步研究。

本研究检测了试验大鼠肠道内的PLG和葡萄糖转运体GLUT-2的mRNA量，以解释冠突散囊菌茶下调高糖、高脂大鼠的空腹血糖和血脂的初步机理[16]。结果发现，其可下调GLUT-2的mRNA量。同时，也明显提升了胰高血糖素原基因的mRNA。具体机理尚待深入研究。