黄芩苷对大肠杆菌AcrB外排泵的抑制作用及其机制

赵子玉，张 鹏，王春光，张 铁

(河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001)

抗生素不仅是人类抵抗病原微生物感染的最主要手段，还为畜禽健康养殖提供了重要保障。但是，抗生素的不规范应用和滥用现象在全球范围内均有发生，从而导致了耐药细菌的出现和传播[1]，因此需要寻找一种新的抗菌途径，来应对细菌的耐药。目前大肠杆菌的耐药已经出现多重耐药，并且呈现逐年上升的趋势[2-4]。外排泵是引起大肠杆菌多重耐药的生理基础，有研究显示大肠杆菌最主要的药物外排泵为AcrAB-TolC外排泵[5]，该外排泵也是其家族中典型的外排系统[6]。

AcrAB-TolC外排泵是由内膜转运蛋白(AcrB)、外膜通道蛋白(To1C)和周质膜融合蛋白(AcrA)3部分组成[7]，该外排泵由质子驱动力提供能量，AcrB从细胞浆中直接捕获底物，底物会与其胞质中的发夹环相结合，从而导致AcrB整体构象发生变化，通过AcrA的传递作用，TolC构象也发生变化，并与AcrB连接在一起，导致通道开放。该系统中AcrB主要负责识别底物和传导能量，如果AcrB的功能受到干扰或抑制，菌体内的药物浓度将会不断升高，从而使得抗菌药物恢复其杀菌效能。因此，AcrB是非常理想的外排泵抑制剂靶点。

目前，已被证实的大肠杆菌AcrB抑制剂有PAβN[8]、吡喃并吡啶化合物MBX2319(9)[9]、吡啶并咪唑类化合物D13-9001[10]等，这些抑制剂普遍存在毒性大的缺点，因此没有进行临床应用，而寻找安全有效的抑制剂有望解决大肠杆菌的多重耐药。

本试验首先通过虚拟筛选从中药单体数据库中筛选出合适的AcrB外排泵抑制剂—黄芩苷，并通过尼罗红外排试验、内外膜影响试验以及AcrB调控蛋白表达影响试验阐明其主要抑制机制，为临床防治多重耐药菌提供一种外排泵抑制剂。

1 材料与方法

1.1 材料大肠杆菌E320(本实验室测序并保存的多重耐药大肠杆菌菌株，NCBI登录号：CP020933)、大肠杆菌ATCC35218、ATCC25922均购自美国组织细胞收藏中心(ATCC)；头孢噻肟钠、磷霉素钠、氯霉素购自北京酷来搏科技有限公司；黄芩苷(98%)、多黏菌素B、头孢噻肟钠购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；头孢噻吩购自美仑生物技术有限公司；PAβN(≥99%)购自上海麦克林生化科技有限公司；羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)、尼罗红购自北京索莱宝科技有限公司；RNAisoPlus、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自TaKaRa公司；DioC2(3)购自Abbkine生物技术有限公司；荧光分光光度计(JascoFP-750)(日本Jasco公司)；LyightCyler实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)。

1.2 虚拟筛选及作用力分析试验方法参照文献[11]进行。

1.3 联合抑菌试验在横纵方向上分别以抗生素和中药单体最小抑菌浓度(MIC)为初始浓度进行倍比稀释，具体试验方法参照文献[10]。分级抑菌浓度指数(FICI)[12]=MIC(中药单体联合用药)/MIC(中药单体单用)+MIC(抗生素联合用药)/MIC(抗生素单用)。判定标准：FICI≤0.5判定为协同作用，0.52判定为拮抗作用[13]。

1.4 尼罗红外排试验试验分组见表1，具体方法参照文献[11]进行。

表1 尼罗红外排试验菌液处理分组

1.5 qPCR检测黄芩苷与氯霉素对AcrB正负向调控基因表达的影响试验分组见表2，具体方法参照文献[11]进行。

表2 qPCR对正负调控基因表达影响试验菌液分组

1.6 外膜渗透稳定性试验试验分组见表3，具体方法参照文献[11]进行。

表3 外膜渗透性试验菌液处理分组

1.7 内膜质子梯度影响试验试验分组见表4，具体方法参照文献[11]进行。

表4 内膜质子梯度影响试验菌液分组

2 结果

2.1 AcrB外排泵抑制剂的虚拟筛选共筛选得到结合能低于-41.8 kJ/mol的中药单体242个，部分结果见表5，考虑中药单体成分的溶解性、应用广泛性、价格等因素，选取bacalin(黄芩苷)进行后续的研究。

表5 Autodock Vina虚拟筛选的部分中药成分评分结果

2.2 作用力分析通过DS可视化软件可以看出黄芩苷与AcrB蛋白的Phe136形成氢键，与Phe628、Phe178、Val612、Ile277、Phe615、Pro326形成疏水作用力(图1)。

A.黄芩苷与AcrB蛋白结合2D示意图(绿色圆形.氢键的蛋白残基；绿色虚线.氢键；黑色字体.键长；紫色、粉色圆形.疏水作用力残基)；B.甘草酸与AcrB蛋白结合3D示意图(粗棒.配体；细棒.蛋白残基；绿色虚线.氢键；蛋白表面的颜色.疏水作用力；左下角图例.作用力)

2.3 联合抑菌试验通过微量肉汤二倍稀释法测得黄芩苷对大肠杆菌E320的MIC为2.5 g/L，磷霉素钠、氯霉素、头孢噻肟钠对大肠杆菌E320的MIC分别为512，512，1 024 mg/L，磷霉素钠、氯霉素、头孢噻肟钠对大肠杆菌ATCC25922的MIC分别为32，8，2 mg/L。黄芩苷与磷霉素钠联合抑菌时，两者具有协同作用，黄芩苷使磷霉素钠的MIC降为原来的1/8(64/512)；黄芩苷与氯霉素联合抑菌时，两者属于协同作用，黄芩苷使氯霉素的MIC降为原来的1/4(128/512)；黄芩苷与头孢噻肟钠联合抑菌时，两者属于协同作用，黄芩苷使头孢噻肟钠的MIC降为原来的1/4(256/1 024)(表6)。

表6 黄芩苷和抗生素联合抑菌试验

2.4 尼罗红外排试验如图2所示，黄芩苷1.250 g/L组荧光强度(13.7 a.u.)高于0.625 g/L组(12.8 a.u.)并且都高于空白对照组(12.5 a.u.)，加入葡萄糖激活外排泵后，黄芩苷1.250 g/L组荧光强度(12.1 a.u.)下降明显小于0.625 g/L组(10.7 a.u.)，且下降后荧光强度仍保持原有趋势，即高于空白对照组(10.4 a.u.)。

1.空白对照组；2.黄芩苷0.625 g/L组；3.黄芩苷1.250 g/L组；4.25 mg/L PAβN组

2.5 实时荧光定量PCR检测对外排泵基因表达的影响黄芩苷对AcrB调控基因表达量的影响，结果显示，黄芩苷可显著诱导SoxS、SoxR的mRNA下调，氯霉素可显著诱导RpoS的mRNA表达上调，黄芩苷联合氯霉素使用可显著促进AcrR、Fis、MarR、MppA、Rob、RpoS、SdiA的mRNA的表达和抑制AcrB、SoxR的mRNA的表达(图3)。

Control.空白对照组；Bai.黄芩苷组；CHL.氯霉素组；Bai+CHL.氯霉素和黄芩苷联用组;同组内不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.6 外膜渗透稳定性测定如图4所示，黄芩苷0.625，1.250 g/L组与空白对照组在20 min内荧光强度趋于稳定，均无明显上升。

1.空白对照组；2.阳性对照组；3.黄芩苷0.625 g/L组；4.黄芩苷1.250 g/L组

2.7 内膜质子梯度影响试验如图5所示，黄芩苷0.625 g/L组与空白对照组相比基本无变化，黄芩苷1.250 g/L组与空白对照组相比有轻微变化。

1.空白对照组；2.黄芩苷0.625 g/L组；3.黄芩苷1.250 g/L组

3 讨论

3.1 蛋白对接分析目前已知的AcrB抑制剂有MBX2319[10]、D13-9001[13]、CCCP，MBX2319与AcrB疏水阱中5个丙氨酸残基,其中4个(Phe136、Phe178、Phe610、Phe628)有很好的亲和力[14]。本研究通过Autodock vina对黄芩苷与AcrB进行分子对接，结果显示其结合能为-44.7 kJ/mol，通过DS可视化软件分析，主要作用位点为Phe136、Phe178、Phe615、Phe628、Val612、Ile277、Pro326，其主要作用力为氢键和疏水作用力。与目前已知的AcrB抑制剂的作用位点的主要重叠部分主要存在疏水阱中，由此疏水阱是AcrB蛋白抑制剂作用的主要位点。

3.2 联合抑菌作用分析大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵的底物广泛，能够对β内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类、磺胺类等多种抗生素药物呈现高度耐药[15]。本研究中黄芩苷与头孢噻肟钠、氯霉素和磷霉素钠均呈现协同作用(FICI≤0.5)，其中氯霉素与头孢噻肟钠刚好属于大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵底物[16]，一定程度上说明黄芩苷降低多重耐药菌E320的耐药性是由于黄芩苷抑制AcrB的活性引起的。

3.3 尼罗红外排试验分析尼罗红是一种亲脂性染料，在水溶性介质几乎不发出荧光，可以忽略，但是在细胞膜的非极性环境中，其荧光水平会迅速升高，因此可以通过荧光强度的变化来判断尼罗红在细胞内的浓度[17]。尼罗红作为AcrAB-TolC外排泵的底物，在进入到细菌体内后，很快会被外排泵排出体外，但是在加入CCCP的菌液中，菌体的外排功能被抑制，菌体内尼罗红的含量受外排系统的影响很小，菌体内尼罗红的含量会明显上升，葡萄糖可以恢复供能从而使外排泵恢复功能。PAβN是一种已知的作用于革兰阴性菌(例如大肠杆菌AcrB)的主要多药耐药外排泵抑制剂[18]。试验结果显示黄芩苷高剂量组与PAβN(阳性对照)组均高于低剂量组，并且都高于空白对照组，并在加入葡萄糖后，除黄芩苷高剂量组与低剂量组高于阳性对照组外其他趋势基本不变，表明黄芩苷能够使大肠杆菌外排泵的活性受到抑制，从而阻止抗菌药物的外排。

3.4 外排泵相关调控基因表达量分析目前AcrAB-TolC外排系统表达的影响已经被广泛研究，已知的调控蛋白包括AcrR、AcrS、Fis、MarA、MarR、MppA、RamA、Rob、RpoS、SdiA、SoxR、SoxS，其中正向调控蛋白有MarA、SoxS、RamA、Rob、SdiA，MarA调控蛋白是一种转录激活蛋白，由MarA基因编码，其主要作用不仅可以加强AcrAB的启动子和RNA聚合酶的亲和力来完成对AcrAB表达的激活，还可以与TolC基因的启动子结合，从而促进AcrAB-TolC的表达[19]，YAMASAKI等[20]也通过对左氧氟沙星耐药菌株中MarA的表达显著增加证实了MarA的表达可以调控外排泵的表达。MarA还与MarR存在着反馈调节，MarA与MarRAB操纵子的上游区结合，促进MarRAB的转录与表达，同时也促进MarR基因的表达产生MarR调控蛋白，而MarR调控蛋白又会与MarRAB上游区以二聚体的形式结合，抑制MarRAB的转录与表达，调控MarA的水平。

SoxS调控蛋白由SoxS基因编码，属于一种全局调控蛋白，受SoxR的正向调节，可以正向调节超过20个与AcrAB-TolC相关基因的合成，促进AcrAB、TolC的表达从而使细菌产生耐药性[21]。SoxR基因编码的SoxR调控蛋白也能够激发SoxS基因的转录，促进SoxS的表达，从而促进AcrAB-TolC的表达。FERRARI等[22]也发现SoxS调控蛋白可以激活AcrAB的表达。

Rob调控蛋白由Rob基因编码，自身没有活性，只有当癸酸盐、吡啶等化合物与其结合后，才能发挥作用，激活其靶基因的转录[23]。在大肠杆菌中，Rob调控蛋白过表达会增加多种抗生素的低水平耐药性[24]。RamA调控蛋白由RamA基因编码，过表达可能通过诱导AcrAB-TolC外排泵的表达导致细菌出现多重耐药性[25]。

主要负向调控蛋白有AcrR、AcrS、MarR、MppA、RpoS，AcrR调控蛋白由AcrR基因编码，是AcrAB操纵子的阻遏蛋白，其会与AcrAB的启动子以二聚体的形式相结合，来抑制AcrAB的表达[26]。任艳娜等[27]通过在大肠杆菌的AcrR片段插入序列也证实了AcrR的负调控作用。AcrS调控蛋白由AcrS基因编码，HIRAKAWA等[28]发现，在大肠杆菌中，AcrS对AcrAB有抑制作用。MarR基因编码的MarR调控蛋白能够抑制正向调控蛋白MarA基因的转录激活[29]。MppA调控蛋白由MppA基因编码，是AcrB的负调控蛋白，通过降低膜内外质子压力差，从而导致AcrAB-TolC失去能量供应[15]。RpoS调控蛋白由RpoS基因编码，不仅能够控制外排蛋白AcrAB的表达量，从而增加细菌的耐药性[30]。

BLAIR等[31]发现单个或多个Acr基因失活时，所有RND外排泵基因的表达均增加，这种情况的出现可能是外排泵基因的表达存在着反馈调节。ZHANG等[32]发现调控蛋白RamA的表达在AcrA或AcrB单一缺失突变体中显著增加，该发现也一定程度上证实了这一反馈机制存在。

黄芩苷联合氯霉素导致AcrB的表达降低很可能是由于黄芩苷联合氯霉素导致负向调控蛋白AcrR、MarR、MppA、RpoS的过表达引起的，黄芩苷联合氯霉素导致Rob的过表达很可能是由于反馈机制的存在，与AcrB蛋白结合使正常的AcrB蛋白失活，从而促进正向调控蛋白的表达。

3.5 外膜质子浓度影响分析细胞外膜在革兰阴性菌中发挥着渗透屏障的作用，有的化合物可以通过破坏其外膜渗透性导致抗生素透过外膜屏障，从而增加菌体中药物浓度的累积。β-内酰胺酶很容易将头孢噻吩水解，可在490 nm处检测到水解产物。ATCC35218是产β-内酰胺酶质控菌株[33]，因此选用ATCC35218作为试验菌株，当头孢噻吩进入ATCC35218菌体内后，会被菌体内的β-内酰胺酶分解，产物可被紫外分光光度计检测到。多黏菌素是一种多肽类抗生素，会对细菌的细胞膜完整性进行破坏，使细菌膜通透性发生变化，通透性增强，导致细菌死亡[34]，因此选择多黏菌素作为阳性对照。头孢噻吩水解产物的信号强度可以间接反映外膜渗透性的变化。本试验中黄芩苷作用组与空白对照组均未见明显变化，而多黏菌素(阳性对照)组可见明显上升，说明黄芩苷抑制大肠杆菌耐药性不是通过破坏细胞外膜质子浓度来实现的。

3.6 内膜质子梯度影响分析DiOC2(3)是一种膜电位探针，可通过荧光信号来分析其细菌活力，其在细胞内发绿色荧光，由于高电位可引起染料分子发生自聚，使得染料的荧光往红色波长出偏移，可以在荧光分光光度计中检测到红色荧光信号，当加入CCCP后，膜电位会遭到破坏，染料的聚集也会随之消失，导致红色荧光信号降低。未经药物处理的大肠杆菌菌体由于具有完整的细胞膜和正常的膜电位，加入DiOC2(3)后会引起染料的聚集，其膜电位也随之升高，加入葡萄糖以维持该势能的存在，从而维持荧光强度的变化，最后通过加入CCCP破坏现有的质子浓度梯度，细胞内膜原有的质子浓度被破坏，染料聚集消失，荧光强度也将下降到以前的水平。该试验可以检测一定浓度的中药单体下大肠杆菌细胞内膜质子浓度梯度的变化，通过观察其变化，来确定中药单体是否影响内膜质子浓度梯度。本试验中黄芩苷的低剂量组与空白对照组基本无变化，表明质量浓度为0.375 g/L的黄芩苷不会阻碍AcrB外排泵的能量来源。

黄芩苷与其他的AcrB外排泵抑制剂相比(如：PaβN、MBX2319和D13-9001等)具有天然、来源广泛、价廉等优势，有望成为新的AcrB外排泵抑制剂，对治疗耐药菌引发的疾病具有重要意义。

黄芩苷可以抑制多重耐药大肠杆菌E320耐药性，其主要机制：黄芩苷结合大肠杆菌多药外排泵转运蛋白AcrB抑制其外排活性，可提高AcrB负调控蛋白AcrR、MarR、MppA、RpoS的表达使AcrB蛋白的表达降低且不影响细菌内膜质子梯度和外膜通透性，从而造成抗生素在菌体内蓄积从而提高杀菌作用。