壮药千葛颈舒康颗粒质量标准的研究*

覃文慧，梁可文，黄慧学

(1 广西中医药大学，广西 南宁 530200；2 广西中药药效重点研究实验室，广西 南宁 530200；3 桂林医学院，广西 桂林 541199；4 广西麦克健峰丰制药有限公司，广西 南宁 530104)

千葛颈舒康方是广西南宁市武鸣区中医医院的协定方，由千斤拔、鸡血藤、粉葛等12味药材组成，具有通龙路、化瘀毒、止疼痛之功效，临床用于治疗椎动脉型颈椎病，疗效显著[1]。千葛颈舒康方由多味壮药、中药组成，其中千斤拔(壮药名：土黄芩、大力黄、牛尾荡)，味甘、淡，性平，通调龙路，祛风毒，除湿毒，补阳虚，强筋骨，主治风湿痹痛，腰痛，咳嗽等证[2]；粉葛(壮药名同中药)味甘、辛，性凉，调龙路、火路，强筋骨，祛风解毒；鸡血藤(壮药名：勾勒给)， 味苦微甘、性温，通调龙路，活血补血，祛风通络，三药为公药。川芎、乳香、没药、三七行气活血、化瘀止痛，桂枝解肌调和气血为母药。石菖蒲(壮药名：棵息忍)，味辛、苦，性微温，具有调巧坞，祛风毒，调气机，除湿毒，除瘴毒，通龙路，止痛等功效，为帮药。白芍通调气道，生姜(壮药名：兴)，土甘草调和诸药，为带药。诸药合用，共奏通龙路，化瘀毒，止疼痛之功效，可用于CSA导致的颈肩疼痛、眩晕等证。前期已进行了制备工艺的研究，为更好地对该制剂进行质量控制，本研究开展薄层色谱法对千斤拔、鸡血藤和粉葛进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定粉葛中葛根素含量，为有效评价产品质量提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 仪 器

LC-10ATVP型高效液相色谱仪(含 VWD 检测器),日本岛津公司；DV215CD型电子分析天平(精度为 0.0001 g),奥豪斯仪器(上海)有限公司；ME203E/02型电子分析天平(精度为 0.001 g),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；F-040ST型超声波清洗机,深圳福祥科技集团有限公司；薄层预制 G 板,青岛海洋化工厂分厂。

1.2 试 药

千斤拔对照药材(121502-201803)；鸡血藤对照药材(121173-201805)葛根素对照品(110773-201816)；桂枝(121191-201605)；芍药苷(110752-201816)，购于中国食品药品检定研究院。10批次千葛颈舒康颗粒(批号分别为210301，210302，210303，210314，210315，210316，210401，210402，210403，210404)；缺千斤拔阴性样品，缺鸡血藤阴性样品，缺葛根阴性样品，由广西麦克健峰丰制药有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 千斤拔

取千葛颈舒康颗粒5 g，研细，放置于具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声提取20 min，滤过，挥干后加水溶解，再用石油醚(60～90 ℃)振摇提取2次，每次15 mL，分取合并石油醚层，浓缩至1 mL，备用。另取对照药材(千斤拔)1 g，同法制备。再同法制备缺千斤拔的阴性样品溶。吸取上述3种溶液各10 μL，点于硅胶G薄层板上，展开剂为三氯甲烷-苯(3.5:6.5)，展开，显色剂为10%磷钼酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图1。

图1 千葛颈舒康颗粒中千斤拔的TLC图Fig.1 TLC map of Qianjinba in Qiangejingshukang granules

2.1.2 鸡血藤

图2 千葛颈舒康颗粒中鸡血藤的TLC图Fig.2 TLC map of Caulis spatholobi in Qiangejingshukang granules

取千葛颈舒康颗粒5 g，研细，放置于具塞锥形瓶中，加入100 mL乙醇，超声提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加水10 mL使溶解，加入20 mL乙酸乙酯萃取，分取乙酸乙酯液挥干，残渣加甲醇1 mL溶解，备用。另取对照药材(鸡血藤)2 g，加乙醇40 mL，同法制备。再同法制备缺鸡血藤的阴性样品溶。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于硅胶GF254薄层板上，展开剂为二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸(8:1.2:0.3:0.5)，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图2。

2.1.3 粉葛

取千葛颈舒康颗粒2 g，研细，放置于具塞锥形瓶中，加入50 mL乙醇，超声提取20 min，滤过，滤液浓缩至5 mL，备用。另取葛根素对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺粉葛的阴性样品，同法制备。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-氯仿-水(26:9.4:8.1:4)为展开剂，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。结果见图3。

图3 千葛颈舒康颗粒中葛粉的TLC图Fig.3 TLC map of Kudzu powder in Qiangejing Shukang Granules

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：AICHROM C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动性：甲醇-0.3%磷酸溶液(25:75，V/V)；流速：1.0 mL/min；检测波长250 nm；柱温：室温；进样量：10 μL。

2.2.2 供试品制备

取千葛颈舒康颗粒约0.5 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，超声处理30 min，补重，滤过，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，备用；取缺粉葛的阴性样品，同法制备。取葛根素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含葛根素80 μg的溶液。

2.2.3 方法学考察

色谱峰分离良好，阴性无干扰。理论塔板数以葛根素计应不低于4500，分离度大于1.5。结果见图4、图5、图6。

线性关系考察：取葛根素对照品适量，制得每1 mL含葛根素171.0 μg的对照品母液，备用。分别精密吸取上述对照品溶液1、2、3、4、5 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.2.1项下色谱条件进样测定，得回归方程Y=10-5X+3.0927(R2=0.9998)。结果表明，葛根素在17.1～171.0 μg/mL范围内线性好。

精密度试验：按2.2.1项下色谱条件，取对照品溶液(102.6 μg/mL)重复进样测定6次，记录葛根素峰面积。结果葛根素平均峰面积为6766869，RSD为0.70%(n=6)。

图4 葛根素对照品溶液高效液相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatogram of puerarin reference substance solution

图5 供试品溶液高效液相色谱图Fig.5 High performance liquid chromatogram of the test solution

图6 阴性供试品溶液高效液相色谱图Fig.6 High performance liquid chromatogram of negative test solution

稳定性试验：按2.2.2项下制备供试品溶液，取千葛颈舒康颗粒样品(210301)样品溶液于0、2、4、6、12和24 h分别进样分析，结果计算RSD为1.84%(n=6)。

重复性试验：取同一批次样品(210301)，平行5份，按2.2.2项下制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件，记录峰面积，计算含量。结果葛根素平均含量为6.34 mg/g，RSD为1.80%，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品(210301，葛根素含量为6.34 mg/g)9份，每份0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定量的对照品溶液，按供试品溶液方法制备，分析测定后计算，结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=9)Table 1 Sample recovery test results (n=9)

2.2.4 样品测定

取10批千葛颈舒康颗粒样品，按2.2.2项下制备供试品溶液，测定，千葛颈舒康颗粒含量结果见表2。

表2 10批样品中葛根素含量测定结果Table 2 Results of determination of puerarin content in 10 batches of samples (mg/g)

3 结 论

3.1 TLC实验

桂枝：本研究曾参考文献[3]，桂枝中含桂皮醛等成分，供试品加水溶解后用乙醚萃取，萃取液浓缩后，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17:3)为展开剂，喷以二硝基苯肼乙醇试液，置日光下检视。但与对照药材和桂皮醛对照品相应位置上，供试品斑点不明显，因此最终未纳入质量标准。

白芍：本研究还曾参考文献[4]，白芍中含芍药苷等成分，供试品加水溶解后用水饱和正丁醇萃取，萃取液浓缩后，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)为展开剂比较实验，但供试品斑点干扰明显，因此最终未纳入质量标准。

3.2 HLPC实验

流动相选择：本研究曾采用甲醇-水(25:75)为流动相，葛根素与相邻峰分离度较好，但峰形差，常出现前延峰及拖尾现象。参考文献[5]后，采用甲醇-0.3%磷酸溶液(25:75)为流动相，葛根素与相邻峰不仅分离度良好，且峰形良好，因此最终选择甲醇-0.3%磷酸溶液(25:75)为流动相。

检测波长选择：参照文献[6]，以250 nm为检测波长，供试品色谱与葛根素对照品相应位置有相同的色谱峰，且能达到基线分离、线性关系良好，阴性供试品无干扰，因此选择250 nm为检测波长。

3.3 方法评价

本文建立的TLC和HPLC测定条件法重复性好、准确，千葛舒康颗粒的质量控制可采用该方法。