H型高血压首发脑梗死病人MTHFR C677T基因多态性及部分促炎因子水平表达

宋玲玲，樊志勇，丘 宇，温德树，马莉琴

原发性高血压是常见的心血管疾病之一，占高血压病人的90%以上，发病率和死亡率逐年升高，且呈年轻化趋势[1]。H型高血压是原发性高血压的一种类型，主要特点为病人血浆同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平≥10 μmol/L[2]。根据6城市(北京、上海、南京、沈阳、哈尔滨、西安)高血压人群调查显示，成年高血压病人中H型高血压约占75%，其中男性比例高于女性[3]。有研究表明，血浆Hcy水平每升高5 μmol/L，心脑血管疾病发生风险约增加59%[4]。因此，Hcy水平升高可作为脑梗死发生的重要危险因素，且控制H型高血压对防治心脑血管疾病的发生具有重要的临床意义。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是蛋氨酸循环中的一个关键酶，在叶酸代谢通路中可将5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-methylene tetrahydrofolate，5，10-CH2-THF)转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate，5-MTHF)，其中碱基突变多发生在667位点[5]。MTHFR C677T基因多态性导致丙氨酸被缬氨酸取代，从而引起酶活性降低和Hcy水平升高，包括野生CC基因型、纯合突变TT基因型和杂合突变CT基因型3种类型[6]。目前，关于基因多态性与高血压或脑卒中相关的研究报道较多[7-8]，MTHFR C677T基因多态性与H型高血压和脑梗死的报道较少。本研究通过对2018年1月—2020年1月我院收治的120例脑梗死病人进行研究，探讨H型高血压首发脑梗死病人MTHFR C677T基因多态性及部分促炎因子水平表达。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月—2020年1月我院收治的脑梗死病人120例，其中男77例，女43例；年龄46～70(56.78±1.20)岁；高血压病程8～20(14.33±3.65)年。根据是否发生H型高血压将病人分为脑梗死组和H型高血压首发脑梗死组，其中脑梗死组67例，H型高血压首发脑梗死组53例；同时选取我院同期健康体检者60名作为对照组。所有研究对象或家属对本研究内容完全知情，均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 脑梗死符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》[9]中的相关诊断标准，经头部CT、MRI或弥散加权成像(DWI)证实；H型高血压符合中国高血压防治指南修订委员会修订的《中国高血压防治指南2010》[10]中的相关诊断标准，即收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90 mmHg，同时Hcy≥10 μmol/L。对照组为血压、血糖、肝功能、肾功能等实验室检值和影像学体检无异常，且未发现临床疾病；临床资料完整。

1.2.2 排除标准 心、脑、肾等器官功能严重障碍；近期服用过维生素、叶酸、银杏叶制剂等影响Hcy代谢药物的病人；合并肿瘤、痛风、糖尿病、肝肾疾病或周围血管病；脑卒中病史。

1.3 实验仪器和试剂 台式水银血压计购自江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；Hcy测定使用日立公司的7180型全自动生化分析仪；C反应蛋白(CRP)测定使用基蛋生物科技股份有限公司的Getein 1600荧光免疫定量分析仪；白细胞介素6(IL-6)测定使用罗氏cobase411全自动化学发光分析仪。基因组DNA提取试剂盒及Applied Biosystems7300/7300plus/7500/7500Fast实时定量聚合酶链式反应(PCR)系统购自赛默飞世尔科技公司，并由深圳泰乐德医学检验实验室完成MTHFR基因检测。

1.4 标本收集 记录所有研究对象性别、年龄等一般资料，采用符合计量标准校正过的台式水银血压计测量血压。空腹12～14 h，抽取静脉血，其中一管为血清生化管，采集5 mL，肝素抗凝，1 h内以3 000 r/min离心10 min，分离血浆检测生化指标；另一管采集5 mL，EDTA抗凝，置于4 ℃冰箱保存，用于提取DNA；一管为血清生化管，采集5 mL，肝素抗凝，4 ℃下静置2 h，分层出现血清时，以3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，置于-80 ℃冰箱保存，检测促炎因子水平。

1.5 观察指标

1.5.1 血浆 Hcy 测定 采用7180型全自动生化分析仪通过循环酶法测定血浆Hcy含量。实验步骤严格按照说明书进行操作。

1.5.2 生化指标 采用P-800全自动生化分析仪测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FBG)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.3 促炎因子 采用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测病人血清IL-6、CRP水平。实验步骤严格按照说明书进行操作。

1.6 MTHFR C677T基因多态性

1.6.1 DNA提取 使用血液基因组DNA少量抽提试剂盒法提取人类白细胞基因组DNA，操作严格按照说明书进行，提取后的DNA置于-20 ℃冰箱内保存备用。

1.6.2 设计引物 使用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查询MTHFR C677T基因所在的DNA序列信息，明确其前后序列：TTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAG[C/T]CGATTTCATCATCACGCAGCTTTTC，再利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件进行PCR引物设计。正向引物序列：5′-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG-3′，反向引物序列：5′-CAAAGAAAAGCTGCGTGATGATGATGA-3′。由深圳泰乐德医学检验实验室合成后溶解待用。

1.6.3 聚合酶链反应(PCR)扩增 采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)扩增目的基因片段。PCR反应体系为25 μL，常规配制，包括模板DNA 3.0 μL，正向、反向引物(10 μmol)各0.5 μL，PCR master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。应用PCR梯度基因扩增仪扩增目的基因片段。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性60 s，59 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，36个循环。之后72 ℃延伸5 min。取PCR产物5 μL，使用20 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6.4 限制性内切酶分型 反应体系为32 μL，包括PCR扩增产物10 μL，限制性内切酶Hinf Ⅰ 2 μL，10×Buffer R 2 μL，ddH2O 18 μL。37 ℃下消化过夜，待酶切反应终止后，将其产物用90 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，室温恒压100 V下电泳9 min后，使用硝酸银染色35 min，之后在凝胶成像仪下观察并照相，对进行基因分型。

1.6.5 PCR产物基因测序 随机选取不同基因型的PCR产物，送至深圳泰乐德医学检验实验室测序分析，验证电泳结果。

2 结 果

2.1 3组临床资料比较 3组性别、年龄、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FBG、Cr、ALT、AST比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。脑梗死组和H型高血压首发脑梗死组收缩压、舒张压、脉压均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；脑梗死组收缩压、舒张压、脉压均高于H型高血压首发脑梗死组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2 基因PCR检测及基因型结果 PCR扩增后，得到198 bp的片段。经过限制性内切酶Hinf Ⅰ酶切后，凝胶成像仪发现3种基因型：野生CC基因型，即酶切后产生一个198 bp的片段，在成像仪下可见一个198 bp的条带；纯合突变TT基因型，即酶切后产生175 bp和23 bp 2个片段，在成像仪下仅见一个175 bp的条带；杂合突变CT基因型，即酶切后产生198 bp、175 bp和23 bp 3个片段，在成像仪下仅见198 bp和175 bp的两个条带。详见图1。

图1 各基因型PCR扩增图

2.3 3组MTHFR C677T多态性基因型和等位基因频率分布 各组3种基因型总体分布频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。脑梗死组和H型高血压首发脑梗死组CC基因型频率均低于对照组，TT、CT基因型频率均高于对照组，等位基因T频率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。脑梗死组CC基因型频率高于H型高血压首发脑梗死组，CT基因型频率低于H型高血压首发脑梗死组，差异有统计学意义(P<0.05)。H型高血压首发脑梗死组等位基因T频率高于等位基因C频率，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 3组MTHFR C677T多态性基因型和等位基因频率分布 单位：例(%)

2.4 3组促炎因子水平比较 H型高血压首发脑梗死组血清IL-6、Hcy和CRP水平高于脑梗死组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；脑梗死组血清IL-6、Hcy和CRP水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 3组促炎因子水平比较(±s)

2.5 促炎因子与Hcy水平的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示：血清IL-6、CRP水平与Hcy水平呈正相关(r值分别为0.221，0.208，P<0.05)。

3 讨 论

国际上将成年人空腹血浆Hcy水平>10 μmol/L定义为高同型半胱氨酸血症，并将伴有高同型半胱氨酸血症的原发性高血压称为H型高血压[11]。多项研究表明，血浆Hcy与心脑血管疾病的发生风险密切相关，且高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病发生的独立危险因素，且高同型半胱氨酸血症和高血压在增加心脑血管病风险上具有协同作用，因此，H型高血压病人易发生心脑血管疾病[12-13]。Hcy是一种人体内的含硫氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程的中间产物，本身并不参与蛋白质合成，其含量主要与遗传、营养、雌激素水平、年龄等因素有关[14]，MTHFR、胱硫醚缩合酶(CBS)、甲硫氨酸合成酶(MS)3种关键酶缺乏或活性降低可影响Hcy代谢。目前临床研究较多的是轻中度高同型半胱氨酸血症，而MTHFR基因 C677T位点突变是发生高同型半胱氨酸血症常见的一个遗传因素[15]，主要机制：5-MTHF是Hcy主要代谢途径中再甲基化过程的甲基供体，在MTHFR作用下由5，10-CH2-THF代谢生成；若MTHFR缺乏或活性下降，减少5-MTHF生成，抑制Hcy再甲基化过程，造成Hcy在细胞内蓄积，从而导致Hcy浓度升高。

血糖、血脂异常是心血管疾病的主要危险因素，与动脉粥样硬化具有共同的生物代谢基础[16]。本研究结果显示：H型高血压首发脑梗死组和脑梗死组TC、TG、LDL-C、HDL-C、FBG、Cr、ALT、AST水平比较，差异无统计学意义。说明H型高血压未导致病人血脂、血糖异常。目前，Hcy导致心血管疾病发生的机制尚未完全明确，可能与以下机制有关：①Hcy造成内皮细胞功能失调，导致内皮素过度分泌，可直接和间接促进一氧化氮合酶辅助因子氧化，从而导致一氧化氮浓度降低，血管舒张功能异常[17]。②Hcy可引起氧化应激反应，产生过氧化氢和超氧化物，损伤内皮细胞，降低转甲基化反应，促进平滑肌细胞增殖，激活粒细胞和血小板黏附、聚集[18]。③Hcy可产生过氧化氢和超氧化物，刺激平滑肌细胞增殖，导致血管内胶原成分增加，微纤维成分减少，从而使血管壁增厚，并破坏血管顺应性。④Hcy可诱导肾动脉血管重构，抑制胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)活性，减少内源性H2S生成，导致血管功能进一步受损[19]。MTHFR C677T基因多态性与高血压、脑梗死易感性有关，TT、CT基因型可增加罹患高血压及脑梗死风险[20]。本研究结果显示，3组3种基因型总体分布频率存在差异，且基因型分布以杂合突变CT基因型最多，与刘宇等[21]研究结果一致。脑梗死病人TT、CT基因型频率及等位基因T频率高于正常人群，所有脑梗死人群TT基因型Hcy水平高于CT基因型和CC基因型，说明TT基因型可能是脑梗死发生的风险基因型，携带等位基因T人群发生脑梗死可能性高于未携带人群。本研究结果显示，H型高血压首发脑梗死组CT基因型频率高于脑梗死组，且CT基因型脑梗死发病率高于CC基因型和TT基因型，说明CT基因型可能是脑梗死病人发生H型高血压的风险基因型。

H型高血压病人存在高血压及高同型半胱氨酸血症心脑血管疾病的危险因素，双重作用下可进一步活化炎症反应和氧化应激反应，促进炎性因子释放，从而损伤动脉血管内皮细胞，导致动脉壁弹性降低，形成粥样斑块，与脑梗死的发生密切相关[22]。IL-6、Hcy、CRP是重要的炎性因子，具有强大的促炎活性，在机体免疫反应中发挥着重要的作用，可促进炎性细胞在血管内膜浸润及动脉粥样硬化斑块形成[23-24]。IL-6是一种多效应细胞因子，主要参与适应性免疫调控，且一定程度受IL-1β分泌的影响，在炎症反应急性期可抑制TNF-α合成[25]。本研究结果显示，H型高血压首发脑梗死组血清IL-6、Hcy、CRP水平均高于脑梗死组和对照组，且IL-6、CRP水平与Hcy呈正相关，说明高同型半胱氨酸血症可过度激活炎症反应及氧化应激反应，并参与脑梗死病人H型高血压发生过程。

综上所述，H型高血压首发脑梗死病人MTHFR C677T基因多态性与IL-6、Hcy、CRP水平有一定的相关性，且在高血压首发脑梗死病人中进行Hcy水平检测和MTHFR C677T基因多态性测定，有助于早期发现动脉粥样硬化，为心血管疾病的早期预防和危险人群的筛选提供新思路。