基于LC-MS/MS 法的玄麦甘桔颗粒中麦冬及山麦冬的检查

汤珺，谭志伟

吉安市食品药品检验检测中心，江西 吉安 343000

玄麦甘桔颗粒是一种在临床使用较为普遍的中成药，具有祛痰利咽和清热滋阴等功效，主要用于虚火上浮、阴虚火旺、咽喉肿痛和口鼻干燥等症状。该制剂由麦冬、玄参、甘草和桔梗四味药材等量制成，其中麦冬清心热养胃阴，是该制剂中的一味重要药材。麦冬来源广泛，市场上流通品种较多，2020 年版《中国药典》收载的麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬的干燥块根，主产于浙江、四川［1］。山麦冬为百合科山麦冬属植物湖北麦冬或短葶山麦冬的干燥块根［1］，主产于湖北、山东、福建。由于山麦冬产量大、价格低、与麦冬形态相近，部分厂家为降低生产成本，在投料时掺入山麦冬的情况时有发生［2-6］。

玄麦甘桔颗粒现行标准仅对甘草、玄参两味药材通过鉴别、含量测定等方法予以质量控制，对麦冬的质量控制尚未做要求［1］。据文献报道,麦冬和山麦冬的化学成分存在较大差异,如麦冬中富含高异黄酮类化合物而山麦冬中少含或不含该类化合物［7-8］，甲基麦冬黄烷酮A 和甲基麦冬黄烷酮B 是麦冬的有效成分；湖北麦冬和短葶山麦冬含有麦冬中没有的山麦冬皂苷B 和短葶山麦冬皂苷C 两种成分［9-11］。本研究通过建立玄麦甘桔颗粒中甲基麦冬黄烷酮A 和甲基麦冬黄烷酮B（麦冬的有效成分），以及山麦冬皂苷B 和短葶山麦冬皂苷C（山麦冬的特征性成分）的含量测定方法，为该药品质量控制和市场监管提供更科学、更有效的技术支撑。

1 仪器与试药

WatersVevoTQ-S 液相色谱串联三重四级杆质谱仪；AR2140 电子天平；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，超声功率500 W，40 KHZ）；对照品：甲基麦冬黄烷酮A（批号RDD-J7111805017，纯度99.96%），甲基麦冬黄烷酮B（批号RES-J07202106004，纯度99.46%），购于成都瑞芬思生物科技有限公司；山麦冬皂苷B（批号111907-201804，纯度98.6%），短葶山麦冬皂苷C（批号111908-201102，纯度99.5%）购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，水为屈臣氏纯净水；玄麦甘桔颗粒30 批，均为市售。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液（60∶40）；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 µL。

2.2 质谱条件

ESI 电喷雾离子源，毛细管电压，±3.5 kV；脱溶剂气温度，500 ℃；碰撞气，氩气；采用正负离子扫描，多反应监测模式（MRM）；优化的质谱条件参数见表1，各成分离子流色谱图见图1。

图1 各成分离子流色谱图：A.甲基麦冬黄烷酮A；B.甲基麦冬黄烷酮B；C.山麦冬皂苷B；D.短葶山麦冬皂苷C

表1 待测组分质谱参数

2.3 混合对照品储备液和混合对照品溶液的制备

分别精密称定甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、山麦冬皂苷B 和短葶山麦冬皂苷C 四种对照品，加甲醇制成含量分别为1 203.52、529.13、415.70、455.71 ng/mL 的混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液1 mL，至5 mL 量瓶中，加60%乙腈溶液定容，摇匀，制成混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取玄麦柑桔颗粒样品，研细，精密称取20 g，精密加入甲醇20 mL，称重，超声处理30 min，放冷后补重，取上清液滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.5 阴性样品溶液的制备

按玄麦甘桔颗粒的处方比例,制成缺麦冬药味的阴性样品,如“2.4”所述方法制成阴性样品溶液。

2.6 阳性对照溶液的制备

取“2.5”所述阴性样品，分别加入甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、山麦冬皂苷B 和短葶山麦冬皂苷C 四种成分，如“2.4”所述方法制成阳性对照溶液。

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性实验取上述阴性样品溶液、阳性对照溶液和混合对照品溶液按“2.1”和“2.2”所述方法进行检测，结果显示混合对照品分离度好，阴性样品溶液无干扰，表明方法专属性良好，见图2。

图2 各溶液总离子流图：A.混合对照品溶液；B.阳性对照溶液；C.阴性样品溶液；D.供试品溶液

2.7.2 线性关系考察分别精密吸取上述混合对照品储备液0.2 mL、0.5 mL、1 mL、5 mL、10 mL，至10 mL 容量瓶中，加60%乙腈定容，摇匀，制成每1 mL 含甲基麦冬黄烷酮A 为24.07、60.18、120.35、601.76、1 203.52 ng，含甲基麦冬黄烷酮B 为10.58、26.46、52.91、264.56、529.13 ng，含山麦冬皂苷B为8.31、20.78、41.57、207.85、415.70 ng，含短葶山麦冬皂苷C 为9.11、22.79、45.57、227.86、455.71 ng的系列混合溶液，分别进样。以峰面积（Y）为纵坐标，待测成分质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，四种待测组分的线性范围见表2。

表2 4种成分的线性范围

2.7.3 检出限和定量限取“2.3”项下的混合对照品溶液稀释至不同浓度，进样测定，分别以信噪比（S/N）3∶1、10∶1 为检出限、定量限，测得上述四种成分的检出限分别为1.20、0.53、0.42、0.46 ng/mL，定量限分别为4.0、1.77、1.4、1.53 ng/mL。

2.7.4 精密度试验精密吸取“2.3”所述混合对照品溶液，按“2.1”和“2.2”项下方法，连续进样6 次，四种成分峰面积的RSD 分别为0.8%、0.9%、1.1%、0.8%。

2.7.5 重复性试验精密称取检出山麦冬皂苷B 的样品，按“2.4”项下平行制备6 份，进样分析，测得甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、山麦冬皂苷B 平均含量分别为26.33 ng/g、132.60 ng/g、279.61 ng/g，另取检出短葶山麦冬皂苷C 的样品，同法平行制备6 份，进样分析，测得短葶山麦冬皂苷C 的平均含量为346.64 ng/g，四种成分的RSD 分别为2.3%、1.9%、2.6%、1.7%，表明方法重复性良好。

2.7.6 稳定性试验精密吸取“2.7.5”项下制备好的检出山麦冬皂苷B 的供试液一份，分别于0、12、24、36、48 h 进样分析，记录峰面积，甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、山麦冬皂苷B 三种成分的峰面积RSD 分别为2.8%、1.9%、2.3%；另精密吸取“2.7.5”项下制备好的检出短葶山麦冬皂苷C 的供试液一份，分别于0、12、24、36、48 h 进样分析，记录峰面积，短葶山麦冬皂苷C 的峰面积RSD 为2.5%。结果表明供试品在室温下，放置48 h内的稳定性良好。

2.7.7 回收率试验采用加样回收试验，取检出山麦冬皂苷B 且已知含量的同一批号样品，研细，精密称取9 份，每份10 g，分别精密加入含甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、山麦冬皂苷B 高、中、低（120%、100%、80%）三种浓度的对照品溶液各3 份，同“2.4”项下方法进行处理,按“2.1”和“2.2”项下方法进行测定，计算加样回收率，甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、山麦冬皂苷B的平均回收率分别为103.2%、91.1%、93.6%；另取检出短葶山麦冬皂苷C 且已知含量的样品，研细，精密称取9 份，每份10 g，精密加入含短葶山麦冬皂苷C 高、中、低（120%、100%、80%）三种浓度的对照品溶液各3 份，同法处理和测定，计算加样回收率为95.6%，结果表明本方法回收率良好。

3 样品的测定

取市售30 批玄麦甘桔颗粒（涉及13 家生产企业），如“2.4”所述方法制备成供试品溶液，分别进行测定。结果见表3，其中2 批检出山麦冬皂苷B，1 批检出短葶山麦冬皂苷C，提示企业存在麦冬与山麦冬混用情况；30 批样品中，甲基麦冬黄烷酮A 和甲基麦冬黄烷酮B 的含量相差较大，其中最高和最低相差10 倍以上，提示各生产厂家所使用的麦冬药材质量参差不齐，可能存在使用劣质药材投料或投料不足的情况。

表3 三十批样品测定情况 ng/g

4 讨论

实验尝试采用TLC 法、HPLC 法对四种待测成分进行检测，但TLC 法中，优化的展开系统和样品前处理方法的前提下，仍旧无法避免杂质斑点的干扰；HPLC 法中尝试采用不同的流动相，四种成分始终不能达到有效分离，两种方法的灵敏度均无法满足实验要求。LC-MS/MS 法专属性强、灵敏度高，且能简化样品的前处理过程，缩短进样时间，提高准确性和实验效率，故最后确定此法进行实验。

样品处理方法采用回流、超声、震荡提取三种不同前处理方法，前处理时间分别选取30、45、60 min，经比对，震荡提取效果不佳，回流和超声提取效果相当，三个不同提取时间所提取的样品经测定待测组分含量无明显差异，故最后确定采取超声30 min 作为样品处理方法。

实验对流动相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液以及两者之间的比例进行了考察，实验结果表明流动相采用乙腈-0.1%甲酸溶液（60∶40）时，被测组分峰形较好，分离效果佳。

对四种成分分别进行了正、负离子扫描，结果显示甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 和短葶山麦冬皂苷C 在负离子监测模式下基线噪音小、响应较好，而山麦冬皂苷B 在正离子监测模式下基线噪音小、响应较好，因此，实验采用正负离子模式对四个成分进行扫描，同时选择离子丰度较高的一组离子对作为定量离子对，并在此基础上优化碰撞能量和锥孔电压。

《中国药典》2020 年版中使用麦冬的成方制剂（120 余个）远远超过使用山麦冬的制剂（3 个），两者在市场的需求量相差甚远，生产过程中存在山麦冬掺伪麦冬的可能。此外，山麦冬替代麦冬投料的报道也屡见不鲜［3-7］，并在本实验结果中得到进一步证实。本实验建立的LC-MS/MS 法检测玄麦甘桔颗粒中麦冬与山麦冬混用情况，对进一步提高该制剂药检验标准，弥补现有标准中麦冬质量控制的盲点，促使生产企业规范性投料，起到了积极作用。此外，鉴于质谱分析方法的高选择性，其他处方中含有麦冬的成方制剂亦可参照本方法进行测定。