HPLC 双波长切换法同时测定不同产地牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量

李晓艳，张侠，张紫微，王朋，陈庆

安徽宏方药业有限公司，安徽 亳州 236800

牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，主要分布于山东、山西、安徽、河南等地，是安徽道地药材之一，具有活血化瘀，清热凉血的作用［1-4］。牡丹皮中除了丹皮酚含量较高外，也含有较多的单萜类成分［5-8］，如含量较高的芍药苷。芍药苷作为牡丹皮的主要活性成分［9-11］，2020 年版《中国药典》中仅收载丹皮酚作为牡丹皮含量测定的检测指标。因此，增加芍药苷作为牡丹皮含量测定的指标成分［12-15］，更好地控制牡丹皮的质量是十分必要的。

本研究同时测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚两种有效成分，建立了准确可靠的检测方法，并用于不同产区的牡丹皮质量差异的对比［16-19］。结果表明，此法可对牡丹皮的质量进行全面、有效地控制。

1 材料与仪器

1.1 试药与试剂

牡丹皮药材（编号：S1～S20，分别购自山西、山东、湖北、安徽、河南等地）；丹皮酚（批号：110708-201407，含量：99.9%），芍药苷（批号：110736-202044，含量：96.8%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸为色谱纯；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（配置四元泵、DAD 检测器、化学工作站、HP compaq 计算机系统，安捷伦科技有限公司）；XP26 型百万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多集团）；BT224S 型万分之一天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；BSA822-CW 型百分之一天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；XL-300 型多功能摇摆式粉碎机（上海润实电器有限公司）；JL-360 型超声提取器（上海吉理仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦Eclipse Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈，0.1%磷酸溶液分别为流动相A 和B，按表1 进行梯度洗脱；检测波长：0～20 min，232 nm，20～40 min，274 nm；流 速：1.0 mL/min；柱温为25 ℃；进样量：10 μL。理论板数按芍药苷和丹皮酚峰计算，应分别不低于5 000、7 000。

表1 梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取丹皮酚、芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 分别含丹皮酚0.10 mg、芍药苷0.06 mg 的混合溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取牡丹皮药材粉末（过四号筛）约0.3 g，置250 mL 具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）40 min，放冷至室温后再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 µm 滤膜，即得。

2.3 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、80%甲醇（空白对照溶液）、供试品溶液各10 μL，分别采样，色谱图见图1。检测结果显示，供试品中芍药苷和丹皮酚与相邻色谱峰分离效果良好，且与对照品峰保留时间一致，空白对照溶液无干扰，表明专属性较强。

图1 HPLC色谱图：A.空白对照溶液；B.混合对照溶液；C.供试品溶液

2.4 线性关系考察

精密称取芍药苷对照品3.016 mg，丹皮酚对照品3.009 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，作为对照品储备液。精密吸取储备液5 mL、1 mL、0.2 mL、0.04 mL、0.02 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成不同浓度对照品溶液，见表2。以峰面积峰值（y）为纵坐标，对照品溶液浓度（x）为横坐标，进行线性回归，求得芍药苷和丹皮酚回归方程分别为y=13 905x+1.828，r=1.000 0；y=49 712x+36.714，r=0.999 9。芍药苷和丹皮酚分别在0.000 6～0.291 9 mg/mL；0.000 6～0.300 6 mg/mL 浓度范围内呈现良好的线性关系。

表2 混合对照品浓度表 mg/mL

2.5 精密度试验

取供试品（编号：S02）0.3 g，精密称定，按“2.2.2”制备供试品溶液，根据上述的色谱条件进行分析，重复6 次进样。结果：牡丹皮中芍药苷峰面积RSD为0.64%；丹皮酚峰面积的RSD 为0.55%，表明仪器具有良好的精密度。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，在48 h 内分时段进样。检测结果显示，供试品溶液中芍药苷和丹皮酚峰面积的相对标准偏差分别为1.48%、1.60%，表明供试品溶液在48 h 内具有良好的稳定性。

2.7 重复性试验

取供试品（编号：S02）0.3 g，平行6 份，精密称定，按“2.2.2”制备供试品溶液，按上述色谱条件精密吸取供试品溶液10 μL，测定。供试品溶液中芍药苷和丹皮酚的含量分别为1.01%、2.08%，RSD 分别为1.00%、1.05%，表明此方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取供试品（编号：S02）0.15 g，精密称定，平行6 份，精密加入含有对照品（芍药苷：1.531mg，丹皮酚：3.136 mg）的80%甲醇各50 mL,按“2.2.2”制备供试品溶液，计算平均回收率。结果芍药苷平均回收率为101.50%，RSD 为0.53%；丹皮酚平均回收率为99.40%，RSD 为1.28%，表明该方法加样回收率良好。见表3。

表3 加样回收率试验结果

2.9 耐用性试验

考察了3 个厂家的色谱柱（Agilent5 HC-C18、Agilent Eclipse Plus C18、LC AQ-C18 色谱柱）；并考察了不同柱温（20、25、30 ℃），流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），进样量（5、10、15 μL）等因素对牡丹皮（编号：S02）含量测定结果的影响，结果见表4，表明该方法具有良好的耐用性。

表4 耐用性试验结果

2.10 20 批不同产地牡丹皮的含量测定

取不同产地的牡丹皮粉末约0.3 g，精密称定,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并注入高效液相色谱仪中进行测定。按照标准曲线法计算牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量，结果表明牡丹皮中丹皮酚含量为0.74%～2.84%，芍药苷的含量为0.24%～1.76%。其中，河南平顶山产的牡丹皮中丹皮酚的含量为0.74%，低于2020 年版《中国药典》规定的1.2%，具体检测结果见表5。可见不同产地的牡丹皮中，不论是芍药苷还是丹皮酚含量均具有较大差异。

表5 不同产地牡丹皮芍药苷和丹皮酚测定结果 %

3 讨论

通过HPLC-DAD 对芍药苷和丹皮酚对照品在190～400 nm 进行紫外扫描，结果发现，芍药苷和丹皮酚分别在232 nm 和274 nm 处有最大吸收，所以选择上述两个波长来分别测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的含量更为准确。为了得到更好的提取效果分别考察了供试品溶液制备的提取溶剂和时间，试验发现以80%甲醇提取40 min 时，丹皮酚和芍药苷的提取率最高，因此选择80%甲醇超声提取40 min 为牡丹皮供试溶液的制备方法。实验考察了不同流动相组成、不同流动相比例、不同色谱柱等对实验效果的影响，发现采用C18 色谱柱和乙腈-0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱，色谱图的峰形较好，且芍药苷和丹皮酚的分离度均大于1.5，符合《中国药典》要求。

本实验建立了HPLC 双波长切换法同时测定牡丹皮中芍药苷和丹皮酚含量的方法。此方法简单易操作，专属性强，准确度较好，并且稳定可靠，能够为牡丹皮的品控提供保障。