己酮可可碱干预氧化应激线粒体机制在氯气致大鼠急性肺损伤中的作用

刘萌萌，赵晨茜，刘姗姗，刘江正，孔德钦，刘 瑞，郭 鹏，海春旭，张晓迪

(1武警后勤学院卫生勤务系，天津 300309； 2空军军医大学军事预防医学系军事毒理学与防化医学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，特殊作业环境危害评估与防治教育部重点实验室，陕西 西安 710032)

氯气是一种黄绿色、强刺激性化学气体，曾作为窒息性化学武器被大量使用于战争中，目前作为重要化工原料被广泛用于现代工业生产中。氯气毒性剧烈且密度比空气大，如果防护不当，一旦泄漏容易造成群体性急性中毒事件[1-3]。氯气中毒以呼吸道损伤为主，易致急性肺损伤(acute lung injury，ALI)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)，严重时可导致死亡，目前其中毒机制不清，尚缺乏特效救治药物[4]。有研究表明，线粒体氧化应激损伤可能参与了氯气导致的ALI[5-6]。己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)属于甲基黄嘌呤的衍生物，临床上常用来改善微循环[7]。文献[8]报道，PTX可通过干预白细胞和内皮细胞相互作用减轻脓毒血症引起的肺损伤。临床研究发现，PTX可能通过调控A2A受体途径，作为抑制新型冠状病毒肺炎导致的肺部炎症的治疗策略[9]。本文以PTX干预氧化损伤-线粒体机制为切入点展开研究，为氯气中毒特效药物研发提供研究思路，也为临床救治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

氯气购自常州市京华气体有限公司；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；Mito SOX染料购自美国Invitrogen公司；线粒体外膜转位酶20(translocase of the outer mitochondrial membrane 20，TOM 20)鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；过氧化氢酶(catalase, CAT)兔多克隆抗体购于中国Proteintech Group公司；β-actin鼠多克隆抗体和PTX均为美国Sigma公司产品；超微量ATPase、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、 还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒均为南京建成科技有限公司产品；激光共聚焦显微镜为奥林巴斯公司产品；动式染毒柜为天津合普科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物饲养 成年雄性SD大鼠24只，体质量为 (200±20) g，每笼6只，购自空军军医大学动物实验中心[许可证号：SCXK(陕)2014-002]。大鼠饮用自来水，垫料为锯末，12 h/12 h明暗交替，环境温度为(24±2)℃，相对湿度为(50±10)%，在染毒前12 h禁食不禁水。

1.2.2 动物分组和处理 实验动物适应性喂养1周。氯气暴露前1 d称取动物体质量后随机分为：对照组、氯气暴露组、PTX干预组(氯气暴露)、单纯PTX组(空气暴露)，每组6只。氯气暴露组和PTX干预组大鼠被置于染毒柜中给予1 200 mg/m3氯气暴露染毒，时长5 min，对照组和单纯PTX组大鼠单独放入干净染毒柜中，相同流速空气暴露5 min后取出。PTX干预组和单纯PTX组于暴露前30 min和暴露后15 min分两次分别给予100 mg/kg PTX灌胃，对照组和氯气暴露组给予等量生理盐水灌胃，灌胃标准为0.1 mL/100 g。染毒结束后3 h，腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，行气管插管，结扎右侧支气管，左肺以5 mL的4 ℃无菌生理盐水进行肺泡灌注，生理盐水回收率为80%左右。右肺经生理盐水漂洗、滤纸吸干后，取中叶于40 mL/L多聚甲醛中固定24 h；其余右肺组织置于-80 ℃超低温冰箱保存待用。

1.2.3 肺组织HE染色 右肺中叶于40 mL/L多聚甲醛中固定、石蜡包埋后切片(厚度3～4 μm)。烤片后脱蜡至水，行HE染色，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片后，光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

1.2.4 肺组织线粒体活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平检测 5 μmol/L Mito SOX染料和10 μmol/L HOECHST染料混合，覆盖于10 μm厚新鲜肺组织冰冻切片，室温避光孵育30 min，4 ℃ PBS缓冲液洗涤3次，甘油封片，共聚焦显微镜600倍下观察荧光强度。

1.2.5 肺组织线粒体超微结构观察 取右肺下叶，40 mL/L戊二醛固定，磷酸缓冲液冲洗，切成1 mm3立方体，25 mL/L戊二醛固定，脱水、包埋、超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染，透射电镜下观察肺组织线粒体超微结构改变。

1.2.6 大鼠肺通透指数计算 大鼠腹主动脉采血后，置于含肝素的抗凝管中，轻柔摇匀，1 500 r/min离心10 min，分离上清备用；左肺灌注液于4 ℃条件下2 000 r/min离心10 min，取上清液分装。严格按照试剂盒操作步骤，使用全波段酶标仪(Infinite M200PRO，奥地利)测定大鼠支气管肺泡灌注液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和血浆A562 nm值并计算蛋白浓度。肺通透指数=BALF中的总蛋白浓度/血浆蛋白浓度。

1.2.7 BALF中氧化损伤及肺组织中ATP酶相关指标的测定 左肺灌注液于4 ℃条件下2 000 r/min离心10 min后，取上清分装；准确称量50 mg肺组织，加入1 mL预冷生理盐水，冰浴条件下匀浆，于4 ℃条件下1 000 r/min离心10 min，制备50 g/L匀浆，取20 μL稀释10倍，即5 g/L匀浆。严格按照试剂盒操作步骤，测定BALF 中MAD、GSSG和GSH含量，SOD活力以及肺组织中Na+， K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase活力，其余部分于-80 ℃保存。

1.2.8 肺组织中CAT和TOM 20蛋白的测定 剪碎100 mg肺组织，置于匀浆器中，与1 mL裂解液混合后研磨，冰上裂解30 min，14 770 r/min离心20 min，弃沉淀。取20 μL蛋白定量，其余样品加入2×SDS上样缓冲液，100 ℃加热10 min后分装样品，-80 ℃冰箱保存备用。样品电泳，常规转模、封闭、孵育抗体、清洗、ECL化学发光后，使用Quantity One灰度分析软件对CAT和TOM 20蛋白表达进行半定量分析。

2 结果

2.1 氯气暴露后大鼠肺组织病理学改变

氯气暴露3 h后，与对照组相比，肺组织体积增大，出现肺损伤。100倍光学显微镜下观察肺组织病理结构：对照组肺泡组织结构完整，形态正常，无明显渗出(图1A)；氯气暴露后3 h，可见肺泡融合、间隔变窄，肺泡壁断裂，肺泡腔内出现血性渗出物，肺泡结构紊乱(图1B)。

2.2 氯气暴露后大鼠肺组织线粒体ROS的变化

Mito SOX是一种线粒体荧光探针，被活细胞线粒体内的超氧化物氧化后与核酸结合产生红色荧光。通过测定组织细胞内红色荧光的强度，可反映细胞线粒体内超氧化物的含量。共聚焦显微镜600倍镜下，氯气染毒3 h后，氯气暴露组肺组织红色荧光强度高于对照组(图2)，说明氯气暴露可引起肺组织ROS水平升高。

2.3 氯气致肺血管内皮细胞线粒体结构变化

在透射电镜下可见对照组肺组织血管内皮细胞线粒体形态正常，呈卵圆形或杆状，内嵴清晰，基质均匀一致，未见线粒体肿胀及空泡变性(图3A)。氯气暴露后3 h，线粒体数量增多，透光度不均，嵴结构模糊，长短径趋于相等，外膜断裂呈碎片状，基质疏松，线粒体肿胀明显且空泡化(图3B)，提示氯气暴露能够导致肺血管内皮细胞线粒体结构发生异常，可能参与了ALI的发生和发展，靶向线粒体可能具有一定的保护作用。

2.4 PTX对大鼠肺通透指数的干预作用

肺通透指数是肺血管通透性改变和ALI程度的一个重要指标[10]。采用BCA法检测大鼠肺通透指数，结果显示，氯气染毒后3 h，氯气暴露组肺通透指数显著高于对照组(P<0.05)；与氯气暴露组相比，PTX干预可降低因氯气染毒引起的肺通透指数异常(P<0.05，图4)。提示PTX在氯气致ALI中具有保护作用。

2.5 PTX对氯气暴露大鼠BALF中氧化损伤的干预作用

氯气染毒后3 h，BALF中MDA含量、SOD活力、GSSG水平显著高于对照组(P<0.05)；与氯气暴露组相比，PTX干预可显著降低MDA和GSSG 水平(P<0.05)，但对SOD活性无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，氯气暴露后，GSH含量、GSH/GSSG比值降低(P<0.05)，PTX干预可逆转这些趋势(图5)。

2.6 PTX对氯气暴露大鼠肺组织CAT蛋白表达的干预作用

采用Western blotting检测肺组织CAT蛋白表达结果显示，与对照组相比，氯气暴露后3 h，大鼠肺组织抗氧化蛋白CAT蛋白表达下降(P<0.05)；与氯气暴露组相比，PTX干预可显著上调因氯气染毒引起的表达异常(P<0.05，图6)。提示PTX可能通过上调CAT的表达，改善肺部氧化损伤。

2.7 PTX对氯气暴露大鼠线粒体相关蛋白TOM 20表达的干预作用

检测肺组织中TOM 20的表达，结果显示，与对照组相比，氯气暴露可引起TOM 20蛋白表达升高(P<0.05)；与氯气暴露组相比，PTX干预能够降低TOM 20蛋白表达(P<0.05，图7)。提示氯气暴露引起线粒体数量应激性升高，PTX处理可使其显著下降。

2.8 PTX对氯气暴露大鼠肺组织ATPase活力的干预作用

ATPase主要存在于细胞膜上，对肺泡渗出液的清除以及紧密连接蛋白的表达发挥重要作用[11]。与对照组相比，氯气损伤后3 h，肺组织Na+, K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase活力升高(P<0.05)；与氯气暴露组相比，PTX干预可显著降低升高的ATPase活性(P<0.05，图8)。

3 讨论

氯气作为重要的化工原料和经典化学武器，除因意外泄漏或战争使用造成人民生命和财产的巨大威胁外，还是恐怖分子进行化学袭击时的常用毒物，临床上治疗以吸氧、机械通气和激素等对症支持为主[3]，限制其特效药物研发的瓶颈问题是中毒机制不清。已知氯气遇水生成次氯酸和盐酸，可刺激黏膜和上呼吸道，引起畏光、流泪等眼结膜刺激症状以及支气管痉挛、黏液增加、气道抵抗等呼吸道症状，高浓度氯气可深入肺泡，引发弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致ALI甚至死亡[2]。本研究在大鼠染毒实验中发现，氯气损伤后，肺组织体积增大，肺泡壁变薄甚至断裂，部分肺泡腔内出现血性渗出液，肺组织破坏明显；检测肺微血管内皮细胞线粒体超微结构发现线粒体肿胀、嵴断裂，甚至线粒体双层膜断裂，损坏严重，说明线粒体是氯气中毒的重要靶细胞器。

氧化损伤是由于ROS大量产生引发的氧化还原平衡失调[12]。在正常情况下，机体通过细胞呼吸链氧化磷酸化产生少量ROS，发挥信号转导作用，维持机体正常的生理过程。体内抗氧化系统包括抗氧化酶和抗氧化物质，抗氧化酶类主要包括SOD、CAT、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶等，抗氧化物质主要有GSH和抗坏血酸等[13]。ROS大量生成时，SOD可催化超氧阴离子转化为过氧化氢，在CAT的作用下生成O2和H2O，进而将ROS清除；GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的催化作用下，可以有效降低脂质过氧化物和过氧化氢水平[14]。在病理情况下，大量ROS产生，抗氧化物质被消耗，氧化还原稳态被打破，引发级联反应，导致脂质过氧化产物MDA堆积。本研究发现，氯气暴露3 h后，肺组织红色荧光强度升高，BALF中MDA、GSSG水平和SOD活力升高， CAT蛋白表达水平、GSH含量以及GSH/GSSG比值下降，提示氯气暴露引起肺组织发生显著的氧化损伤，原因可能是：①氯气暴露直接产生过量的ROS；②氯气暴露引起SOD活力应激性升高，产生大量过氧化氢，又因CAT活性降低，造成大量ROS在组织细胞中堆积；③过量产生的ROS大量消耗GSH等抗氧化物质，产生GSSG等氧化物。因此，我们推测在氯气致大鼠ALI过程中，氧化损伤可能是其发生的重要环节和损伤机制，这与DE GENARO等[5]和ELFSMARK等[15]的相关报道一致。LU等[16]认为N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)通过激活Nrf2/GR/GSH信号通路能有效抑制不同动物模型的肺损伤，但Ⅰ、Ⅱ期临床试验均证实NAC未能降低ALI患者病死率，NAC的保护作用在临床上存在争议。因此，基于关键机制阻断进行的有效药物研究仍有待深入探索。

PTX属于甲基黄嘌呤的衍生物，是一种非特异性磷酸二酯酶抑制剂，可通过抑制环腺苷酸转变为腺苷酸，提高细胞内环磷酸腺苷水平。PTX能够改善外周微循环的灌注，除具有免疫抑制、改善血流动力学和抗纤维化等药理学作用外，还具有抗氧化功能[17-19]。周涛等[20]研究结果显示，PTX在大鼠脑缺血再灌注损伤模型中，通过调节Nrf2-ARE信号通路，减轻了氧化损伤，具有显著的保护作用。以往实验主要关注PTX在肺部疾病中的抗炎功能， PTX预处理可通过抗炎作用缓解多种ALI动物模型损伤的严重程度[21]。本研究发现，PTX干预可降低氯气损伤后大鼠肺组织中的MDA和GSSG水平，升高GSH含量、GSH/GSSG比值以及 CAT蛋白表达水平，提示其具有较好的抗氧化作用，我们推测PTX可能通过提高CAT蛋白表达水平，帮助更好地清除过量过氧化氢，防止GSH的过度消耗，进而减少脂质过氧化的发生和发展。

线粒体是ROS产生的主要细胞器，我们进一步观察了线粒体的变化。TOM 20蛋白定位于线粒体外膜上，由线粒体基因组编码，可以部分反映线粒体数量和功能[22]。我们检测了肺组织TOM 20蛋白的表达水平，发现TOM 20蛋白表达水平在氯气暴露后显著升高，PTX干预降低了TOM 20蛋白表达水平，说明氯气暴露可能引起线粒体数量应激性升高，PTX可使这一异常变化得到逆转。为了更进一步探讨，本研究检测了肺泡表面存在的ATP依赖的Na+, K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase的活性，肺泡上皮的Na+, K+-ATPase能够将Na+从肺泡腔转移到肺泡间质，促进水肿液清除[23]；Ca2+, Mg2+-ATPase与钙稳态失衡密切相关，在病理条件下，ATP能量供应异常，Ca2+, Mg2+-ATPase功能异常，引起细胞外Ca2+内流和细胞质Ca2+超载，导致离子代谢紊乱，影响肺内渗出液清除率，导致肺通透指数异常。我们推测氯气进入机体后，生成的次级代谢产物可能作用于线粒体，引起线粒体数量应激性升高，ATP生成增加，ATPase活性变化，进而引发相应病理效应。本研究发现氯气暴露引起Na+, K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase活性升高，这与HAN等[23]的研究结果相反，考虑在染毒条件下，本结果与Na+, K+-ATPase和Ca2+, Mg2+-ATPase活性的应激性升高有关。PTX可以降低其活性，这有利于清除过量的渗出液，减轻肺损伤。肺通透指数的测定验证了这一作用。

综上所述，本研究发现在氯气引起的肺损伤过程中，PTX除了发挥自身抗氧化作用外，可通过影响线粒体数量和ATPase活性，帮助清除肺泡内过多的渗出液，发挥肺损伤保护作用，进一步的分子机制还有待深入研究。