基于网络药理学和分子对接技术探讨心复力颗粒治疗心力衰竭的作用机制

郭轩彤，马丽红

心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段。《中国心血管健康与疾病报告2019概要》流行病学数据显示，心力衰竭已影响全球约4 000万人，我国心力衰竭现患病人数约为1370万例，较2000年增长44%，再住院率约为69%，住院死亡率约为4%，其高患病率、高住院率和高死亡率给我国经济带来沉重负担，已成为重要的公共卫生问题[1-2]。中医药在减少心力衰竭终点事件、改善临床症状和预后、提高生活质量、降低死亡率方面具有多途径、多靶点的治疗特点和优势。临床研究显示，中药可显著降低慢性心力衰竭病人心血管不良事件发生率，中药的多种活性成分通过抗氧化、抗炎、改善能量代谢等途径拮抗心力衰竭发生发展[3]。

心复力颗粒是北京名医丁鸣九治疗慢性心力衰竭的经验方，主要由人参、黄芪、黑顺片、丹参等组成，作为内部制剂，在中国医学科学院阜外医院临床应用50余年，疗效显著。前期研究发现，心复力颗粒可改善慢性心力衰竭病人临床症状，提高左室射血分数，降低血浆脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)水平；通过调节能量代谢、抑制心肌细胞凋亡和心肌纤维化等机制发挥心力衰竭心肌保护作用[4-5]。由于心复力颗粒成分多样，活性成分复杂，药理作用具有多靶点、多途径、多层次的特点，因而常规基础研究难以全面揭示心复力颗粒的作用机制，极大阻碍了药物优化和临床应用发展。

网络药理学是基于药物和疾病的网络数据库检索、高通量组学数据分析和计算机虚拟计算的新兴药理学方法，通过构建并分析生物网络实现对药物与疾病交叉作用靶点的初步预测，广泛用于中药的基础机制研究。分子对接是以空间结构为基础，依据配体与受体作用“锁-钥原理”，预测分子相互作用的一种模拟技术。本研究通过网络药理学方法，筛选得到心复力颗粒治疗心力衰竭的活性成分和潜在作用靶点，并结合基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析结果，初步探讨心复力颗粒治疗心力衰竭的潜在分子作用机制。利用分子对接技术，进一步模拟预测心复力颗粒潜在药效成分与心力衰竭作用靶点之间的结合模式与强度，从而为心复力颗粒在心力衰竭中的治疗优化和研究提供线索和依据。

1 资料与方法

1.1 数据库、软件和网站 数据库包括TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetpredic tion.ch/)、GeneCards(http://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/)、STRING(https://stringdb.org/)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)、PDB(http://www.rcsb.org/)。使用软件包括SAS 9.4(http://www.sas.com/)、Cytoscape 3.7.0(https://cytoscape.org/)、AutoDock Tools 1.5.6(http://autodock.scripps.edu/resources/adt)、PyMol(https://pymol.org/)。使用在线网站包括韦恩在线绘制(http://jvenn.toulouse.inra.fr/)、Bioinformatics (http://www.bioinformatics.com.cn/)。

1.2 心复力颗粒药效成分及作用靶点的筛选 以人参、黑顺片、茯苓、丹参、槟榔、黄芪、三棱、木瓜和葶苈子为心复力颗粒主要成分，在TCMSP数据库中进行检索，获取所有化学成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选标准，构建心复力颗粒药效成分数据库。利用PubChem数据库获取药效成分的Canonical SMILES序列，并在SwissTargetPrediction数据库中以可能性分值>0.1、居前15位作为筛选标准，得到心复力颗粒药效成分作用靶点，构建心复力颗粒药效成分靶点数据库，同时检索TCMSP数据库中靶点信息，对数据库进行查漏补充。

1.3 心力衰竭相关作用靶点的筛选 以“heart failure”“congestive heart failure”“cardiac failure”“cardiac insufficiency”“coronary failure”为心力衰竭关键词，在GeneCards数据库及DrugBank数据库中检索心力衰竭相关作用靶点，以相关性分数>30为筛选标准，建立心力衰竭作用靶点数据库。

1.4 心复力颗粒与心力衰竭相互作用网络的构建 使用SAS 9.4软件对心复力颗粒药效成分靶点数据库和心力衰竭作用靶点数据库进行合并分析，导出交叉共同靶点，建立心复力颗粒治疗心力衰竭靶点数据库。利用韦恩图在线网站绘制心复力颗粒治疗心力衰竭潜在靶点韦恩图。将心复力颗粒治疗心力衰竭靶点数据库导入STRING数据库，得到靶点互作关系图，构建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络模型。使用Cytoscape 3.7.0软件对网络拓扑学参数进行分析，以Degree值居前10位为筛选标准，构建心复力颗粒治疗心力衰竭关键靶点数据库。

1.5 靶点通路富集与可视化分析 将心复力颗粒治疗心力衰竭的潜在靶点数据库导入DAVID数据库，进行GO、KEGG富集分析，得到心复力颗粒治疗心力衰竭的潜在理论上的生物学过程与代谢通路。将结果上传至Bioinformatics网站，绘制高级气泡图及基因富集分析柱状图，对结果进行可视化分析。

1.6 分子对接分析 结合心复力颗粒、心力衰竭关键靶点数据库与GO、KEGG富集分析结果，通过PubChem数据库和PDB数据库下载得到拟分析的心复力颗粒药效成分和心力衰竭作用靶点3D晶体结构。使用PyMol软件对3D结构进行去水、加氢等预处理。使用AutoDock Tools 1.5.6软件进行分子对接分析，获取药效成分与靶点结合的自由能和构象数据，并在PyMol软件中进行可视化分析。

2 结 果

2.1 心复力颗粒成分及靶点 以OB≥30%，DL≥0.18为筛选标准，通过TCMSP数据库检索得到人参药效成分22种、黑顺片药效成分21种、茯苓药效成分15种、丹参药效成分65种、槟榔药效成分8种、黄芪药效成分20种、三棱药效成分5种、木瓜药效成分4种、葶苈子药效成分22种，经合并整理后，获得心复力颗粒药效成分共160种。详见表1。将心复力颗粒药效成分导入PubChem和SwissTargetPrediction数据库，获得心复力颗粒药效成分作用靶点575个。

表1 心复力颗粒药效成分基本信息

2.2 心复力颗粒治疗心力衰竭潜在靶点 检索GeneCards数据库和DrugBank数据库，获取心力衰竭作用靶点355个。使用SAS 9.4软件对心复力颗粒药效成分作用靶点与心力衰竭作用靶点进行重复性分析，提取到共同作用靶点62个，即心复力颗粒治疗心力衰竭靶点。将心复力颗粒治疗心力衰竭靶点与心复力颗粒内单药的药效成分作用靶点进行比对分析，获得单药药效成分治疗心力衰竭的潜在靶点114个，其中，人参潜在靶点27个、黑顺片潜在靶点12个、茯苓潜在靶点7个、丹参潜在靶点39个、槟榔潜在靶点9个、黄芪潜在靶点46个、三棱潜在靶点19个、木瓜潜在靶点36个、葶苈子潜在靶点45个。详见图1、图2。

图1 心复力颗粒药效成分作用靶点-心力衰竭靶点Venn图

图2 心复力颗粒药效成分作用靶点-心力衰竭靶点网络图

2.3 心复力颗粒治疗心力衰竭的潜在药效成分-作用靶点PPI网络 将心复力颗粒治疗心力衰竭靶点导入STRING数据库，得到心复力颗粒治疗心力衰竭PPI网络。结果显示：PPI网络共61个节点、656条边，高于同等数量下随机蛋白互作关系度，提示心复力颗粒治疗心力衰竭靶点蛋白之间存在高度生物相互作用关系，心复力颗粒治疗心力衰竭有明确机制可循，详见图3。将PPI网络导入Cytoscape 3.7.0软件，通过“Network Analyzer”进行分析，发现网络内节点59个、边656条，最短路径3 422条，网络中心度0.406，平均邻居节点数22.237个，聚类系数0.716，无孤立蛋白节点，进一步证实心复力颗粒治疗心力衰竭PPI网络靶点相互作用紧密，心复力颗粒治疗心力衰竭存在确切的作用机制。导出富集组织为心脏且关联强度Degree值居前10位的靶点，构建心复力颗粒治疗心力衰竭关键靶点数据库，包括：内皮素1(endothelin-1，EDN1)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、趋化因子2(CCL2)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、肿瘤蛋白p53(tumor protein 53，TP53)、血管细胞黏附因子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)、纤溶酶原激活物抑制因子1(serpin family E member 1，SERPINE1)、小窝蛋白(caveolin 1，CAV1)、选择素-E(selectin E，SELE)。详见表2。

图3 心复力颗粒治疗心力衰竭作用靶点PPI网络

表2 心复力颗粒治疗心力衰竭关键靶点基本信息

2.4 靶点通路富集分析与可视化分析 提交心复力颗粒治疗心力衰竭作用靶点至DAVID数据库，进行基因富集分析，包括KEGG通路、GO的生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，以富集值为筛选标准，取前20位的分析结果导入Bioinformatics平台，绘制气泡图及基因富集分析柱状图进行可视化分析。详见图4、图5。

图4 心复力颗粒治疗心力衰竭KEGG通路分析结果

图5 心复力颗粒治疗心力衰竭GO富集分析结果

KEGG通路富集分析结果显示，共94条代谢通路可能与心复力颗粒治疗心力衰竭的分子机制相关，主要包括信号传递、免疫系统、能量代谢、血管新生，内分泌激素等。前期研究已初步证实心复力颗粒通过促进改善心肌能量代谢和血管新生，调节氧化应激等机制发挥心力衰竭心肌保护作用。进一步研究对缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)信号通路、核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体(NOD-like receptor，NLRs)信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路等及关键作用靶点VEGFA、EDN1、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、蛋白激酶Cα(PRKCA)、NOS3和肾素(REN)在心复力颗粒治疗心力衰竭的作用机制进行深入探讨。

GO功能富集分析结果显示，共399种潜在分子生物功能与心复力颗粒治疗心力衰竭的作用相关，主要包括平滑肌细胞增殖、去甲肾上腺素作用下心脏收缩与心率调节、细胞凋亡及内皮素相关动脉血压调节等321条生物过程；轴突、细胞骨架、RNA转录复合物和细胞表面等31处与细胞成分相关的功能；NO合酶活性、肾上腺素能受体活性、去甲肾上腺素结合及血管内皮生长因子受体结合等47种分子功能。以上各机制对心复力颗粒治疗心力衰竭的作用机制进行了初步概括与揭示。

2.5 分子对接分析 EDN1是血管平滑肌和心肌细胞合成并分泌的具有强烈缩血管作用的活性肽，在心力衰竭中表达升高，通过活化磷脂酶C促进血管平滑肌细胞收缩，升高血压，并可激活蛋白激酶C引起心肌细胞肥厚和纤维化，影响心力衰竭的发生发展。多项临床研究显示，血浆EDN1浓度与心力衰竭病人短期院内临床终点事件和住院死亡率呈正相关，拮抗EDN1的治疗策略可使病人获益[6-8]。VEGFA是血管新生的重要作用因子，可促进缺血心肌内分支血管生成，改善冠状动脉血流灌注和心肌氧供，通过磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphatidylinositide 3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路抑制心肌细胞凋亡[9]。心复力颗粒治疗心力衰竭PPI网络拓扑学参数分析结果显示，EDN1与VEGFA是心复力颗粒治疗心力衰竭的关键靶点，关联Degree值居首位。GO、KEGG富集分析提示，HIF-1信号通路是心复力颗粒发挥心力衰竭心肌保护作用的机制中重要潜在通路，而HIF-1信号通路激活引起下游VEGF通路与EDN1通路活化，促进血管新生与血管张力调节。课题组前期研究结果初步证实，心复力颗粒可降低心力衰竭大鼠心肌内EDN1含量，改善心肌缺氧与细胞凋亡[5]。因此，初步以VEGF信号通路和EDN1信号通路作为本研究切入点，探讨心复力颗粒是否通过结合EDN1降低其循环含量，拮抗不利作用，同时选取VEGFR和EDNR为心复力颗粒作用靶点，探讨心复力颗粒通过结合受体发挥药效作用的可能机制。 检索心复力颗粒药效成分靶点数据库，选取丹参中的有效成分木犀草素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA；槟榔中的有效成分原花青素；黄芪、葶苈子和木瓜中的有效成分五羟黄酮进行分子对接分析。详见表3。

表3 心复力颗粒药效成分与心力衰竭作用靶点的分子对接结果

对接结果显示，心复力颗粒药效成分与心力衰竭相关靶点的结合自由能均为负值，提示其结合为自发放能反应，可形成稳定复合物，为心复力颗粒的药效作用机制提供了理论基础。因此，心复力颗粒治疗心力衰竭的基础作用机制可能通过结合激活或抑制VEGFR和EDNR受体或与EDN1配体形成复合物有关，表明心复力颗粒可能通过调节血压、促进血管新生、抑制心肌纤维化及病理重构发挥药物活性和心力衰竭保护作用，且丹参、黄芪、葶苈子、木瓜及槟榔中含有较多作用成分，为药物优化指明了方向。提交主要结果在PyMol软件中进行可视化，详见图6。

图6 心复力颗粒药效成分原花青素与VEGFR分子对接图

3 讨 论

一项中药治疗心力衰竭的系统性综述纳入了芪苈强心胶囊等9项随机对照临床研究，指出中药联合西药可降低心力衰竭病人不良心血管事件发生率，中西医结合是心力衰竭治疗策略的潜在优化方向[10]。心复力颗粒是阜外医院名老中医丁鸣九治疗心力衰竭的经验方，本研究在网络药理学方法基础上，通过构建心复力颗粒与心力衰竭作用靶点PPI网络和GO与KEGG基因富集分析，发现心复力颗粒中160种药效成分可作用于心力衰竭62个相关靶点，其中关键靶点包括EDN1、VEGFA、NOS3、CCL2、IL8、TP53、VCAM1、SERPINE1、CAV1和SELE等，涉及信号通路包括HIF-1信号通路、TNF信号通路、NLRs信号通路、VEGF信号通路等。在前期研究基础上，选取关键靶点通路进行分子对接分析，实现对心复力颗粒治疗心力衰竭潜在机制的科学系统分析。

3.1 心复力颗粒治疗心力衰竭现有证据分析 网络分析与数据库检索结果显示，参与心复力颗粒治疗心力衰竭的114种药效成分主要来自丹参、人参、黑顺片、茯苓、槟榔、黄芪、三棱、木瓜和葶苈子。相关研究表明，丹参通过作用于核受体类视黄醇X受体α和核因子(NF)-κB通路减轻氧化应激导致的能量代谢障碍和心肌肥厚，提高线粒体功能[11-12]。人参通过调节心肌能量代谢发挥心力衰竭保护作用外，还可介导腺苷酸活化蛋白激酶-结节性硬化症蛋白2-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase-tuberous sclerosis 2-mammalian target of rapamycin，AMPK-TSC2-mTOR)信号通路参与细胞自噬的调节，通过调节多种炎性介质表达实现对心肌肥厚和心室不利重构的抑制[13-14]。黑顺片通过线粒体合成相关的组蛋白脱乙酰酶/过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(sirtuin 1/peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator，Sirt1/PGC-1α)信号通路促进线粒体合成及钙离子信号通路和心肌收缩相关基因SERCA2a表达的调节，提高心力衰竭大鼠心功能[15-16]。在减轻心脏负荷方面，茯苓通过作用于水的重吸收相关精氨酸加压素-血管加压素受体2-水通道蛋白2(arginine vasopression-vasopressin receptor 2-aquaporin 2，AVP-V2R-AQP2)轴发挥利尿作用，降低心力衰竭大鼠循环BNP含量，拮抗心力衰竭[17]。黄芪作为心力衰竭的常用治疗药物，通过促进血管新生，抑制心肌组织重构和调节心肌能量代谢等作用机制发挥心力衰竭心肌保护作用，并作用于去甲肾上腺素、醛固酮等神经体液因子水平改善心功能[18-19]。葶苈子通过抑制心力衰竭大鼠模型中神经内分泌系统过度激活，改善体内氧化应激失衡，抑制心肌细胞凋亡与心室重构等发挥作用[20]。

检索既往相关文献，心复力颗粒治疗心力衰竭发生发展的关键药效物质可能包括丹参、人参、黑顺片、茯苓、黄芪和葶苈子。心复力颗粒的多种药效成分是否由于相互作用影响其药理机制、已有研究证据缺乏对通路的功能缺失性双重验证、相关药物疗效缺乏设计严密的临床观察或研究佐证等问题，有待进一步解决。

3.2 心复力颗粒治疗心力衰竭关键靶点和通路分析 心复力颗粒治疗心力衰竭关键靶点基因富集分析显示，心复力颗粒通过EDN1、VEGFA、NOS3和SERPINE1作用于HIF-1信号通路；EDN1、CCL2、VCAM1、IL-8和SELE作用于TNF信号通路；NOS3及其他靶点作用于环磷酸鸟苷-蛋白激酶G(cGMP-PKG)和钙离子信号通路；CCL2和IL-8作用于NLRs信号通路；VEGFA、NOS3和TP53作用于PI3K/Akt信号通路；NOS3和VEGFA作用于VEGF信号通路。其中，HIF-1通路在心肌缺氧条件下被激活，通过调节葡萄糖代谢相关酶类基因表达，作用于葡萄糖运输、线粒体氧化磷酸化和ATP生成等途径，导致线粒体功能障碍、代谢紊乱和心肌细胞凋亡，引起不利重构和心功能恶化，通过影响血管新生和心肌炎性反应促进心力衰竭发生发展[21]。TNF信号通路通过促炎作用影响心肌细胞收缩功能，介导微血管炎症和障碍，参与成纤维细胞活化，引起心室重构，使心力衰竭恶化[22]。在心力衰竭心肌神经内分泌活化和心肌损伤刺激下，cGMP-PKG信号通路活化可减轻心肌纤维化，抑制心肌细胞凋亡和调节血管内皮通透性等，已有临床研究初步证实促进cGMP-PKG信号通路可降低心力衰竭病人心血管死亡率和再住院率，改善预后[23]。钙离子作为第二信使，通过影响心肌收缩、促进心肌肥厚与重构相关基因表达和心律失常等机制参与心力衰竭发生发展，作用于线粒体，干扰电子转移与三羧酸循环，引起能量代谢障碍和ATP生成减少[24]。有研究显示，肾上腺素能信号不仅影响心肌收缩力与心肌变力储备，同时引起胰岛素抵抗、心肌纤维化和心室重构，导致心力衰竭；NLRs信号通路通过激活下游NF-κB信号及钙离子信号，引起转化生长因子(TGF)-β等细胞因子分泌、心肌细胞凋亡和纤维化，导致心功能障碍[25]。心力衰竭心肌中VEGF信号通路的激活促进血管新生，提高血管通透性，改善局部血流灌注，通过激活PI3K/AKT信号通路，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，抑制促凋亡蛋白Caspase-3等活性，发挥抑制心肌细胞凋亡和提高血管稳定性作用[26-27]。详见图7。

图7 心复力颗粒治疗心力衰竭潜在的分子机制示意图

结合心复力颗粒中单药成分治疗心力衰竭的研究证据和富集分析结果，本研究从理论层面初步探讨了心复力颗粒治疗心力衰竭的机制可能包括调节心肌能量代谢、抑制不利重构、促进血管新生、减轻心脏负荷、调节细胞凋亡与自噬和抑制神经内分泌系统过度激活等，体现了心复力颗粒治疗心力衰竭多成分、多靶点、多通路的药效特点，从整体探讨了心复力颗粒治疗心力衰竭的潜在机制，为进一步开展基础和临床研究提供理论支持与研究方向。