茵栀黄口服液对溶血性黄疸小鼠模型的退黄作用及有效剂量和安全性研究

邓 惠 李贵平

新生儿黄疸主要表现为目黄、身黄、尿黄，是新生儿常见疾病之一，其发病主要与湿热邪蕴有关，新生儿肺、脾、肾常不足，三焦水道运化水湿不利，湿与热结，湿热熏蒸肝胆，胆汁外溢肌肤，故全身肌肤黄染；且湿困脾胃，脾胃不能运化水湿，加重湿热内困，恶性循环，加重黄染程度[1]。新生儿黄疸是新生儿住院的首要原因[2]，严重时可引起核黄疸，导致听力和神经系统等不可逆损伤。目前临床治疗主要有蓝光照射、换血疗法、药物治疗，但均不良作用明显，费用较高[3,4]。传统中医常用经典名方茵陈蒿汤加减治疗，结合新生儿脾胃虚弱特点，茵栀黄口服液采用黄芩、金银花代替茵陈蒿汤中大黄成分，降低方剂的泻下力量，在临床上使用较广泛，取得了一定的疗效[5,6]，减少新生儿黄疸住院率和住院时间，其具有经济、方便、安全的优点，但是因新生儿个体差异，临床上部分患儿出现腹泻、吐奶、腹胀等不良反应，尤其是溶血性黄疸，有效及安全剂量难以掌握。因此本研究通过对比生理盐水和不同剂量茵栀黄口服液灌胃溶血性黄疸小鼠后，肝功能各项指标、肝组织病理改变，探讨茵栀黄口服液的有效剂量及安全性，以期为临床使用茵栀黄口服液治疗新生儿黄疸提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物健康的昆明小鼠，雌雄各半，体质量17～23 g，共40只，由西南医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(川)2018—17，于西南医科大学动物实验中心适应性饲养，保持室内相对温度19～21 ℃，相对湿度为50%～70%。笼底放置清洁的动物饲养垫料，使用维持饲料喂养，饲料旁放置一个小鼠专用水瓶(内储自来水)，每日定时添加饲料、更换垫料及饮用水。本实验所采用饲料、垫料统一由西南医科大学实验动物中心采购。实验严格遵守动物管理规则和使用原则。

1.2 实验药物茵栀黄口服液(北京华润高科天然药物有限公司，批号：Z11020607)，乙酰苯肼(APH，上海麦克林生化科技有限公司提供)。

2 方法

2.1 造模依据文献制作溶血性黄疸小鼠模型[7，8]，先对40只雌雄各半的小鼠进行适应性喂养5 d后，按雌雄各半比例，将小鼠随机分为造模组32只、正常组8只。将APH溶于生理盐水，按60 mg/(kg·d)的剂量对造模组小鼠进行腹腔注射，正常组小鼠腹腔注射20 ml/(kg·d)生理盐水，连续注射3 d后，与正常组对比，造模组小鼠烦躁，皮毛失去光泽，耳朵等处皮肤变黄，尿液、大便黄，造模成功。

2.2 分组及给药注射APH 3 d后，将造模成功的32只昆明小鼠随机分成4组，每组8只，分别为茵栀黄口服液低、中、高剂量组和模型组。低、中、高剂量组分别灌胃5 ml/(kg·d)、10 ml/(kg·d)、20 ml/(kg·d)茵栀黄口服液(低、中剂量组分别于灌胃药物中分别加入15 ml/(kg·d)、10 ml/(kg·d)生理盐水，使3组灌胃总液体量均为20 ml/(kg·d))，模型组、正常组灌胃20 ml/(kg·d)生理盐水，每天1次，连续灌胃3 d。

2.3 检测血清肝功能各组昆明小鼠灌胃3 d后，眼球取血1.5 ml，送西南医科大学附属中医医院检验科检验，检测血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IBIL)、天门冬氨酸氨基酸转移酶(AST)、丙氨酸氨基酸转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)。

2.4 肝脏病理切片观察将取眼球血的小鼠立即处死，摘取肝脏，取肝脏组织于甲醛中固定，再经脱水、透明后，浸蜡包埋、切片，进行HE染色，于光学显微镜下观察肝细胞结构是否正常。

3 结果

3.1 各组昆明小鼠一般情况比较低、中、高剂量组和模型组小鼠造模后，与正常组小鼠比较，反应迟钝，进食减少，活动减少，个别小鼠出现俯伏、抽动、易激惹、聚堆，小鼠皮毛失去光泽，耳朵皮肤苍黄，尿液黄，大便黄，表明造模成功。低、中、高剂量组小鼠灌胃茵栀黄口服液后反应、进食、活动、皮毛光泽、耳朵皮肤苍黄、二便黄、俯伏、抽动、易激惹、聚堆情况均有不同程度改善。

3.2 昆明小鼠生化指标

3.2.1 昆明小鼠胆红素指标比较与正常组比较，模型组的TBIL、DBIL、IBIL均明显升高，且P<0.05，差异具有统计学意义。低、中、高剂量组与模型组比较，TBIL均降低，其中低剂量组与模型组比较，P>0.05，差异无统计学意义，表明低剂量茵栀黄口服液对降低TBIL无效；中、高剂量组与模型组比较，P<0.05，差异具有统计学意义，表明中、高剂量的茵栀黄口服液对降低TBIL有效；而中、高剂量组比较，P>0.05，差异无统计学意义，表明中、高剂量的茵栀黄口服液降低TBIL的效果不明显；低、中、高剂量组的DBIL与模型组比较，P>0.05，差异无统计学意义，表明茵栀黄口服液对降低DBIL无明显效果。与模型组比较，低、中、高剂量组的IBIL均明显下降，且P<0.05，差异具有统计学意义，表明茵栀黄口服液能明显降低IBIL；其中低、中、高剂量组的DBIL两两比较，P>0.05，差异无统计学意义，表明低、中、高3种剂量的茵栀黄口服液对降低IBIL的效果差异无统计学意义。见表1。

3.2.2 昆明小鼠肝功能指标比较正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的TP、AST、ALT的值，各组之间两两比较，均P>0.05，差异无统计学意义，表明造模前后TP、AST、ALT无明显变化，且茵栀黄口服液对TP、AST、ALT无明显影响。与正常组比较，模型组ALP、ALB降低，GLB、A/G均升高，且P<0.05，差异具有统计学意义，表明造模后ALP、ALB明显降低，GLB、A/G明显升高；模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的ALP、ALB、GLB、A/G的值，各组间两两比较，均P>0.05，差异无统计学意义，表明茵栀黄口服液对ALP、ALB、GLB、A/G无明显影响，说明茵栀黄口服液对肝功能无明显影响。见表2。

表1 各组小鼠血清中胆红素浓度比较

3.3 昆明小鼠肝组织病理改变比较图片A中正常组小鼠肝组织排列紧密整齐，细胞核完整，且大而圆，无明显肝细胞破坏，未见明显炎症细胞。与正常组比较，图片B中造模组肝组织排列疏松，肝组织结构破坏，有明显肝细胞坏死灶，空泡样变性，炎细胞浸润，表明造模后小鼠出现肝组织损伤。与图片B中模型组比较，图片C、D、E中的低、中、高剂量组，肝组织结构排列疏松程度均有所减轻，肝细胞坏死灶减少，空泡样变性减少，有炎症细胞浸润；图片C、D中低、中剂量组比较肝脏病理切片差异不明显；与图片C、D中低、中剂量组比较，图片E中高剂量组肝组织结构排列更疏松，肝组织结构破坏相对较多，空泡样变性相对增多，表明茵栀黄口服液对肝脏组织病理性改变具有一定改善作用，但剂量过大时，对肝组织病理损伤的改善作用降低。见图1。

表2 各组小鼠肝功能比较 (只，

注：A正常组；B模型组；C低剂量组；D中剂量组；E高剂量组。图1 小鼠肝脏病理切片比较

4 讨论

新生儿黄疸，又名新生儿高胆红素血症，其主要表现为胆红素过高出现皮肤黄染、小便黄，原因主要包括胆红素生成过多，血浆白蛋白联结胆红素的能力不足，肝细胞处理胆红素能力差，肠肝循环致重吸收增加[1]。胆红素代谢途径：红细胞衰老分解生成脂溶性的间接胆红素，间接胆红素与血浆白蛋白结合后，进入肝细胞中解离后与Y、Z蛋白结合，在内质网经葡萄糖醛酸转移酶(UDPGT)催化变为水溶性的直接胆红素经肠道、肾脏排出体外[9]。

APH破坏红细胞，造成小鼠血虚，血虚不能荣养肌肤皮毛[10]，故皮毛失去光泽；血虚不能化神，故反应迟钝、进食减少、活动减少；气随血脱，阳气不足，不能温煦全身，故个别小鼠出现俯伏、聚堆等异常行为。《金匮要略》中记载“黄家所得，从湿得之”说明黄疸与湿邪密切相关[11]，湿热熏蒸肝胆，胆汁外溢肌肤而耳朵皮肤黄染，下注膀胱而小便黄，行大肠而大便黄。茵栀黄口服液由茵陈、栀子、黄芩、金银花组成，茵陈、栀子、黄芩均具有清利湿热作用，其中茵陈利胆退黄，乃治黄疸要药，佐以金银花清热解毒。本实验中，低、中、高剂量组与模型组小鼠比较，耳朵皮肤苍黄、小便黄均有不同程度消退，抽动、易激惹情况亦均有改善，茵栀黄口服液从湿邪病因入手，并清热以标本兼治，改善溶血性黄疸小鼠症状。

APH主要通过破坏红细胞，使胆红素生成过多，导致溶血性黄疸[10]。本实验中，造模组小鼠与正常组比较，TBIL、DBIL、IBIL均升高，ALP、ALB均降低，可能是因红细胞破坏过多导致贫血，贫血可诱发ALP降低。溶血致TBIL生成过多，其中主要以IBIL升高为主，造成小鼠耳朵皮肤苍黄。IBIL与ALB结合，消耗导致ALB降低，生成大量DBIL，经由小便、大便排出，导致小便、大便黄染。胆红素过高，透过血脑屏障，影响神经系统，小鼠出现抽动、易激惹等异常。本实验模型组肝脏病理切片提示肝组织损伤，炎症浸润，而当机体发生炎症反应时，可使免疫球蛋白升高，GLB、A/G升高可能与其有关，造模后小鼠可能出现肝炎。中、高剂量组TBIL降低可能与茵栀黄口服液中茵陈、栀子、黄芩、金银花均具有保肝利胆作用相关[12-15]；而低剂量茵栀黄口服液不能降低TBIL，说明低剂量组的剂量低于茵栀黄口服液的有效剂量，中、高剂量组的剂量在有效范围内，而中、高剂量组间TBIL差异无统计学意义，说明茵栀黄口服液的退黄作用强弱可能与剂量无明显关系，但具体有效剂量范围还需进一步研究证明。茵陈能通过增加UDPCT活性，增强肝脏处理胆红素能力[16]，低、中、高剂量茵栀黄口服液均能降低IBIL可能与其有关。DBIL主要通过二便排出体外，而茵栀黄口服液为茵陈蒿汤减去大黄，增加黄芩、金银花变化所得方剂，大黄对大肠、小肠运动均具有增强作用[17]，故而茵栀黄口服液排泄二便能力相对减弱，本实验低、中、高剂量组DBIL与模型组比较差异无统计学意义，可能与其相关。TP、ALP、AST、ALT、ALB、GLB、A/G均为衡量肝功能损伤的指标，其中ALB能与IBIL结合形成DBIL排出体外，降低胆红素，而本实验低、中、高剂量组TP、ALP、AST、ALT、ALB、GLB、A/G与模型组比较差异均无统计学意义，说明茵栀黄口服液可能对肝功能无明显影响，且其退黄作用可能与白蛋白无关，茵栀黄口服液具体退黄机制有待进一步研究。低、中、高剂量组的肝脏病理切片与模型组比较，肝组织疏松、坏死灶、空泡样变性、炎症细胞浸润均有不同程度减轻，茵栀黄口服液能减轻肝脏病理损害，其可能与茵栀黄口服液中茵陈、栀子能减少肝脏MDA生成以减轻肝细胞损害及黄芩能抑制自由基对肝细胞的毒性有关[18-20]；中剂量与低剂量比较改善差异不明显，低、中剂量比高剂量肝组织损伤改善更明显，说明高剂量茵栀黄口服液可能对肝组织病理损伤的改善作用降低，也可能高剂量茵栀黄口服液对肝组织具有一定损害作用，具体作用机制有待学者进一步研究。

本实验由于客观因素限制，实验设计有待进一步完善，实验条件、技术、样本量等因素具有一定局限性，有待学者进一步深入研究。