基于响应面法优化-UPLC-MS/MS测定西洋参中拟人参皂苷F11的方法研究

韩慧琴，姚宝林，张 淼，荆燕燕，尹贻珍*

(1张家口市食品药品检验中心中药室，张家口 075000；2承德市食品药品检验检测中心中药室；3石家庄市食品药品检验中心中药室；*通讯作者,E-mail:hnhiqg668899@Sohu.com)

西洋参为五加科人参属植物，原产于北美洲，以加拿大和美国为主产区，目前我国山东、东北等地区亦引种栽培多年[1]。作为贵细药材，西洋参有养阴润肺、清心安神之功效[2]。从西洋参中分离得到的化合物主要有人参皂苷类、萜类、多糖、黄酮类、维生素等[3-5]。现代药理学研究证实人参皂苷类为主要活性成分，有降血糖，保护心脏，增强记忆力、改善阿尔茨海默病及抗肿瘤等作用[6-9]。拟人参皂苷F11可作为西洋参的质量标记物[10]，可用于西洋参质量的评价与控制。

皂苷类化合物的提取方法有：水煎法、有机溶剂回流法、微波辅助提取法和超声辅助提取法等[11-13]，水煎法或有机溶剂回流法，能耗高、提取率低，且皂苷类成分有被破坏的可能；微波辅助提取效率虽高，但微波辐射不容忽视[14]。超声辅助提取具有效率高、用时短、温度低、适应性广、能耗低、提取药液杂质少，有效成分易于分离纯化等优点[15,16]，目前被广泛应用于试验室和工业化生产中。

本试验以西洋参为研究对象，采用超高效液相色谱-串联质谱(aultra high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法测定拟人参皂苷F11的含量，超声辅助提取法结合星点设计-效应面法优化西洋参中拟人参皂苷F11的提取率，以期达到高效提取拟人参皂苷F11的目的。

1 材料与仪器

BP211D电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)，超高效液相色谱-API 5500三重四级杆质谱联用仪(美国AB公司)；KQ-600DB超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，超纯水仪(成都浩康科技有限公司)。拟人参皂苷F11对照品(批号：110841-202108)、人参及西洋参对照药材(批号分别为120917-201712，120997-201810)均购自成都埃法生物科技有限公司；西洋参样品购自华佗药房连锁有限公司(批号为210506)；乙醇、乙腈均为色谱纯(美国Thermo公司)；超纯水。

2 方法与结果

2.1 拟人参皂苷F11的测定

2.1.1 色谱、质谱条件 色谱条件：Shim-pack GIST C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，2 μm；P/N：227-30001-04；S/N：18I07025)；流动相Ⅰ为乙腈，流动相Ⅱ为水，在不同的时间以不同的比例进行洗脱：0～2 min，80%→50%Ⅱ；2～4.5 min，50%→20%Ⅱ；柱温38 ℃，流速0.3 ml/min；进样量5 μl。

质谱条件：ESI离子源；负离子扫描；多反应监测(MRM)模式；定量离子799.500→653.500(碰撞能量CE：-45 V)，定性离子799.500→491.600(CE：-50 V)。离子源温度500 ℃；离子喷雾电压-4 500 V；雾化气Gas1：50 psi、辅助气Gas2：45 psi。

2.1.2 溶液制备 对照品溶液：用精密电子天平称取拟人参皂苷F11对照品50.25 mg，用色谱纯乙醇100 ml溶解稀释成含有拟人参皂苷F11为502.5 μg的母液，精密吸取40 μl母液置于100 ml量瓶中，用20%乙腈稀释至刻度，作为贮备液(浓度：201 ng/ml)。

供试品溶液：市售西洋参粉碎过40目筛，精密称取1.0 g，置于具塞锥形瓶中，用大肚吸管精密量取25 ml体积分数为80%的乙醇，称定质量，置于超声波清洗仪中超声提取40 min，取出放至室温后，称重，补足缺失质量。提取液过滤，精密量取续滤液500 μl，置100 ml量瓶中，20%乙腈定容至刻度，即得供试品溶液。

西洋参对照溶液：精密称取粉碎过筛的西洋参对照药材1.001 6 g，按“供试品溶液”的制备方法，制备西洋参对照溶液。

人参对照溶液：精密称取粉碎过筛的人参对照药材粉末1.008 3 g，按“供试品溶液”的制备方法，制备人参对照溶液。

所有溶液注入液相色谱仪前需经0.22 μm有机滤膜过滤。

2.1.3 专属性试验 取“2.1.2”项下各溶液，照前述“2.1.1”项下方法进样，比较市售西洋参溶液、西洋参对照药材溶液及人参对照药材溶液中拟人参皂苷F11的情况。试验结果表明拟人参皂苷F11对照品溶液峰形良好，市售西洋参溶液和西洋参对照药材溶液的拟人参皂苷F11峰形对称，灵敏度较高，而人参中未检出拟人参皂苷F11(见图1)，选择拟人参皂苷F11作为西洋参的质量标记物合理可行。

2.1.4 标准曲线 将“2.1.2”项下的对照品贮备液逐级稀释成浓度分别为5.025，10.05，20.10，50.25，100.5 ng/ml的系列对照品溶液，设置自动进样体积为5 μl，按“2.1.1”项下方法进样。以人参皂苷F11的浓度为横坐标(x)，以峰面积为纵坐标(y)得回归方程为y=323.711 7x-717.164 5(r=0.999 2)，线性范围为5.025～100.5 ng/ml，能够满足拟人参皂苷F11的测定。

2.1.5 准确性试验 分别精密称取已知含量为2.679 mg/g粉碎过筛的西洋参样品(批号：210506)9份，每份约1.0 g，精密称定，每3份为一组，分别按样品中含量的50%，100%，150%的量加入拟人参皂苷F11对照品母液3 ml，5 ml和8 ml，照“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法检测，结果平均回收率为98.2%，RSD值为0.9%(见表1)。表明该提取方法可行。

左边图为定量离子对(799.500/653.500)质谱图;右边图为定性离子对(799.500/491.600)质谱图图1 UPLC-MS/MS二级离子流图Figure 1 UPLC-MS/MS Secondary ion flow diagram

表1 拟人参皂苷F11的回收率试验结果 (n=9)

2.1.6 稳定性试验 取同一批西洋参(批号：210506)，照“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法，制备西洋参供试品溶液，室温放置，分别于0，1，2，4，8，12，16，18，24 h，按“2.1.1”项下方法检测。结果所得质量标记物拟人参皂苷F11含量的RSD为0.49%，表明制备好的供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 精密度试验 取同一对照品溶液，按“2.1.1”项下的方法连续进样测定6次，测得拟人参皂苷F11峰面积RSD为0.41%，表明仪器精密度良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声功率的考察 精密称取1.0 g市售西洋参粉末(粉碎过40目筛)5份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入25 ml体积分数为80%的乙醇，密塞，称定质量，设定超声功率分别为240，300，360，420，480 W，超声提取40 min后冷却至室温，称定质量，补足缺失质量。提取液用20%乙腈溶液稀释200倍后用0.22 μm滤膜过滤，注入超高效液相质谱仪测定，结果显示拟人参皂苷F11的提取率随超声功率的增大而增加，但超声功率超过360 W时，提取率反而略有下降(见图2)，原因可能为超声功率过大时对苷类结构有所破坏，故超声功率选择360 W。

图2 超声功率对拟人参皂苷F11提取率的影响Figure 2 Effect of the ultrasonic power on the yield of pseudo-ginsenoside F11

2.2.2 超声时间的考察 精密称取1.0 g市售西洋参粉末(粉碎过40目筛)5份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入25 ml体积分数为80%的乙醇，密塞，称定质量，超声功率设定为360 W，分别提取20，30，40，50，60 min后放至室温，其余操作同“2.2.1”，结果显示拟人参皂苷F11的提取率随超声时间的延长而增加，但超声时间超过40 min时，提取率不再随之增加，反而略有下降(见图3)，故超声时间选择40 min。

2.2.3 乙醇体积分数的考察 精密称取1.0 g市售西洋参粉末(粉碎过40目筛)5份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入25 ml体积分数分别为60%，70%，80%，90%的乙醇及无水乙醇，密塞，称定质量。超声功率设定为360 W，超声提取40 min后放至室温，其余操作同“2.2.1”，结果显示拟人参皂苷F11的提取率随乙醇体积分数的增大而增加，当乙醇体积分数为80%时达到最大值，随后提取率下降(见图4)，分析其原因为拟人参皂苷F11极性较大，在80%乙醇中溶解度较大，故提取溶剂采用80%乙醇。

图3 超声时间对拟人参皂苷F11提取率的影响Figure 3 Effect of the ultrasonic time on the yield of pseudo-ginsenoside F11

图4 乙醇体积分数对拟人参皂苷F11提取率的影响Figure 4 Effect of the ethanol concentration on the yield of pseudo-ginsenoside F11

2.2.4 液料比的选择 精密称取1.0 g市售西洋参粉末(粉碎过40目筛)5份，分别置具塞锥形瓶中，分别加入体积分数为80%的乙醇15，20，25，30，35 ml，即液料比分别为15 ml ∶1 g，20 ml ∶1 g，25 ml ∶1 g，30 ml ∶1 g和35 ml ∶1 g，密塞，称定质量。超声功率设定为360 W，超声时间为40 min，其余操作同“2.2.1”，结果发现拟人参皂苷F11的含量随液料比的增大而升高，但液料比大于25 ml ∶1 g时，含量不再随之增加(见图5)，故选择25 ml ∶1 g的液料比进行优化试验。

图5 液料比对拟人参皂苷F11提取率的影响Figure 5 Effect of the ratio of liquid to solid on the yield of pseudo-ginsenoside F11

2.3 星点设计-响应面法优化提取工艺

根据单因素试验结果，选择超声功率(A)、提取时间(B)、乙醇体积分数(C)和液料比(D)为影响因素，每个因素设置3个水平(见表2)，以拟人参皂苷F11提取率为评价指标，采用Design Expert 8.0.5设计Box-Behnken试验(见表3)，应用Design Expert软件对表3数据进行拟合，求得回归方程，采用方差分析对回归模型进行显著性检验，通过软件分析并由二项式方程模型进行预测分析，确定最佳提取工艺。

表2 因素水平表

表3 Box-Behnken试验方案及提取率

应用Design Expert软件对表3数据进行拟合，得回归方程为：Y=-77.439 37+0.070 38A+1.582 85B+0.678 00C+0.914 85D+0.000 19AB+0.000 11AC+0.000 05AD-0.004 39BC-0.000 59BD-0.000 07CD-0.000 12A2-0.018 39B2-0.003 47C2-0.016 99D2，由方程可知，因素A(超声功率)、B(超声时间)、C(乙醇体积分数)和D(液料比)对提取率均为正相关作用。采用方差分析对回归模型进行显著性检验，结果见表4，二项式拟合模型R2=0.977 2，P<0.000 1，表明用二次回归方程拟合模型合适；失拟项P>0.05，失拟不显著，表明回归方程可准确预测实际情况。因素A、C和D的影响显著(P<0.05)；因素B的影响不显著(P>0.05)；交互项中，BC影响显著(P<0.05)，而其他影响不显著(均P>0.05)；A2、B2、C2、D2均显著(均P<0.05)。

表4 回归模拟方差分析表

通过软件分析并由二项式方程模型进行预测分析，确定最佳提取工艺：超声功率为367.06 W，超声时间为34.82 min，乙醇体积分数81.11%，液料比26.69 ml ∶1 g，提取率为2.740 mg/g。考虑到实际操作情况，将其修正为超声功率370 W，超声时间35 min，乙醇体积分数81%，液料比27 ml ∶1 g。

2.4 验证试验

为验证响应面优化结果的可靠性，按上述最优条件进行3次验证试验，结果拟人参皂苷F11提取率为(2.679±0.016)mg/g，与预测值接近，表明本模型可较好地预测实际提取率。

3 讨论

目前关于西洋参提取的研究主要集中在总皂苷、总多糖及多种人参皂苷方面，这些研究为西洋参的深入开发提供了科学依据，但由于生物合成途径相近，导致人参、三七、西洋参所含化学成分相似，人参皂苷类为其共有成分[10]，以总皂苷或人参皂苷为指标，不能真实反映西洋参质量。本试验以西洋参特有成分拟人参皂苷F11作为质量标志物，具有代表性，亦可作为药材判别依据。三萜皂苷类成分紫外吸收弱，液相测定时多采用蒸发光散射检测器[17-19]，该测定方法灵敏度较低，测定效果欠佳；另外西洋参属于贵细药材，在中药成方中用量较少，常规检测手段难以有效控制药物质量，故亟待建立灵敏度更高的检测方法，UPLC-MS/MS具有检测限更低、分析时间快、自动化程度高的优点，可以排除干扰，提升质量控制水平。

皂苷类化合物属于四环三萜类，其母核上有羟基、甲基等不同的取代基，在前期摸条件时选用ESI+与ESI-分别进行扫描，结果ESI+同时出现了[M+H]+和[M+Na]+峰，导致二级质谱分析时母离子的浓度降低，灵敏度较差。试验过程中发现，形成的[M+Na]+峰信号不稳定，[M+H]+峰信号较弱，无法用于样品的检测。改用负离子检测模式后，可以形成[M-H]-峰且信号响应稳定，因此选用ESI-作为离子化模式。对母离子[M-H]-准分子离子峰进行碰撞诱导解离，以获得2次碎裂产生的子离子，分别选择离子丰度高、基线噪声低的离子对作为定性离子对，选择离子丰度最高的离子对作为定量离子对。

试验过程中，笔者发现拟人参皂苷F11的母离子响应值较低，因此不仅按常规的思路优化去簇电压和碰撞能量，对其他参数包括离子源温度、电压、雾化器、辅助气、碰撞气、碰撞室出口电压等都进行了优化，使得响应值达到最高。采用了API2000和API5500两种型号的质谱仪进行测定，结果API5500的检测灵敏度远远高于API2000，故选用API5500进行测定。

本试验采用超声辅助提取的方法，通过Box-Behnken试验设计优化了西洋参中拟人参皂苷F11的提取工艺，并采用专属性强灵敏度高的UPLC-MS/MS法进行检测，可为西洋参的真伪优劣鉴别提供更加可靠的依据。