横向主动脉缩窄术致兔心力衰竭模型的建立

罗庆祎,章体玲,丁云川,陈 剑,赵 丽,王庆慧

(1.昆明市延安医院超声医学科,昆明 650200;2.云南省心血管疾病重点实验室,昆明 650200;3.云南省心脏疾病临床医学中心,昆明 650200;4.昆明市延安医院心内科,昆明650200）

心力衰竭是一种影响人类全身器官的复杂性临床综合征，是几乎所有心血管疾病的最终阶段，对人类健康产生极大威胁［1-2］。为深入研究人类心力衰竭的发生和发展机制，建立稳定可靠的动物模型显得很有必要。既往研究多采用小型实验动物建立心力衰竭模型，但由于小型动物体型较小，该类模型在一些实验应用中受到了限制［3-5］。兔作为一种常用的医学实验动物，体型中等，其心力衰竭的病理过程与人类相似，因此可以作为研究人类心力衰竭的理想模型动物［6］。本研究通过横向主动脉缩窄（transverse aortic constriction，TAC）术致使实验兔主动脉弓缩窄，建立兔心力衰竭模型，然后使用超声评估实验兔的主动脉弓缩窄程度及心功能指标，并与分子生物学及病理学指标相印证，从而探讨TAC术建立实验兔心衰模型的可行性和有效性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级健康雄性日本大耳兔25只，体质量2.0～3.0 kg，由昆明医科大学动物实验中心［SCXK（滇）K2020-0004］提供，动物合格证编号为kmmu210012。实验兔饲养于昆明市延安医院中心实验室动物房［SYXK（滇）K2020-0006］，在清洁环境下饲养，保证兔自由饮食，12 h明/暗循环。正常的动物饲料为协同生物出品实验用兔维持饲料，动物饮用水为反渗透净化水，饲料容器及饮水装置经高温高压灭菌冷却后使用。

本研究动物实验经昆明市延安医院实验动物伦理委员会审查批准，受理编号为2020002，批准文号为2014117。所有动物实验操作符合实验动物3R原则及国内外相关的实验动物福利伦理标准要求。

1.2 动物模型建立

随机将实验兔分为手术组（n=15）和假手术组（n=10）。参照既往研究方法改良进行操作，手术方法如下：以20%乌拉坦10 mL/kg腹腔麻醉动物后，取右侧卧位，固定于手术台上，通过呼吸机控制兔的呼吸频率、潮气量并维持其正常生命体征，常规连接并记录标准导联心电图。备皮后，碘伏消毒胸部术区，在胸骨左缘第二肋间隙水平，剪开皮肤，钝性分离肋间肌，胸腺和组织后暴露主动脉弓远心端，用27 G针头垫在左锁骨下动脉下方约2 cm处，剥离主动脉鞘，以0-5丝线结扎主动脉弓远心端，然后缓慢抽出针头，逐层关闭胸腔，消毒切口，完成手术［7-9］。术前及术后使用卡洛芬进行镇痛，术前2 h按4 mg/kg的剂量皮下注射给药，术后视动物情况继续给药。术后3 d每天肌内注射100 000 U青霉素抗感染，观察动物体征。假手术组除未结扎外，其余操作相同。手术结扎部位如图1所示，术后正常饲养。

图1 实验兔横向主动脉缩窄术结扎部位图Figure 1 Sites of surgical ligation of the transverse aortic constriction(TAC)in rabbits

1.3 超声评估心功能

采用美国GE公司Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，并配有6 S探头，频率4.4～11.4 MHz。术后4周及8周，使用多普勒超声检测手术组和假手术组兔心功能指标。于术后8周使用多普勒超声评估主动脉弓缩窄程度，以6 S探头于胸骨上窝切面检测实验兔主动脉弓缩窄处血流速度以评估狭窄程度［10-11］。

取左胸骨旁的短轴切面，在二尖瓣腱索水平记录M型超声心动图，分别测量升主动脉内径（ascending aortic diameter，AAOd）、左房舒张末期内径（left atrial end-diastolic diameter，LADd）、左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd）、左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVEDs）、左室舒张末期室间隔厚度（interventricular septal end-diastolic thickness，IVSd）、左室后壁舒张末期厚度（left ventricular posterior wall end-diastolic thickness，LVPWd），计算左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。以上超声数据均由两位经验丰富的超声科医师通过双盲法在连续3个心动周期上测量完成，各指标取其平均值。

1.4 RNA检测

术后8周完成超声检查后，麻醉后采用空气栓塞法处死实验兔，取心脏组织，使用TRIzol法提取左心室总RNA。应用实时荧光定量PCR法测定N-末端脑钠肽前体（N-terminal pro B type natriuretic peptide，NTproBNP）和β-重链球蛋白（β-myosin heavy chain，β-MHC）的mRNA相对表达量（以管家基因GAPDH为内参）［12-13］。

1.5 病理组织学检查

TAC术后8周，超声检查结束后，处死动物并开胸取出心脏。左心室经质量分数4%的甲醛溶液固定，常规脱水，组织采用石蜡包埋，切片，进行HE染色和Masson染色，光学显微镜下观察病理变化。使用Olympus电子显微镜观察和拍摄HE染色和Masson染色切片，同一切片摄取5个不同视野的照片。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 实验动物基本情况

实验组2只兔在7周时因心力衰竭症状较重，抢救无效死亡。第8周时，共存活23只实验兔，其中手术组13只，假手术组10只。13只存活手术组实验兔在术后8周均有显著的不同程度的心衰表现，主要表现为充血性心力衰竭。23只实验兔在术后4周和8周时的超声检查中，透声条件良好，均获得了满意的超声结果。

2.2 降主动脉流速

TAC术后8周，于胸骨上窝切面探查显示，手术组实验兔降主动脉缩窄处探及高速湍流血流信号，该处平均流速为（2.20±0.56）m/s；而假手术组降主动脉平均流速为（0.20±0.03）m/s；手术组的降主动脉流速较假手术组显著加快，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组实验兔的降主动脉流速及对比如图2所示。

图2 多普勒超声检测实验兔降主动脉流速Figure 2 Flow velocity of the descending aorta in rabbits

2.3 心脏彩超指标对比

TAC术后4周，与假手术组比较，实验兔的心率、AAOd、LADd、LVEDd、LVEDs和LVEF未见明显差异（P＞0.05），而IVSd和LVPWd显著增加（P＜0.05）。TAC术后8周，与假手术组比较，实验兔的心率、AAOd、LADd、LVEDd和LVEDs明显增加，LVEF明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中LVEDs增加最为明显，假手术组LVEDs为（4.89±0.68）mm，手术组LVEDs为（8.83±0.72）mm；而IVSd和LVPWd在8周时两组间差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 术后4周及8周实验兔心脏彩超指标变化Table 1 Changes in cardiac ultrasound parameters at 4 and 8 weeks after operation（-x±s,n=5）

2.4 二维超声心动图对比

TAC术后4周，心尖四腔心切面显示，较假手术组对比，手术组左心房、左心室内径轻度增大，IVSd及LVPWd均明显增加，呈向心性肥厚改变；术后8周手术组左心房、左心室内径明显增大，左室壁变薄，呈离心性肥厚改变。以上超声声像图改变均能直观反映手术组和假手术组兔因左心室负荷过重所引起的心脏结构变化（图3）。

图3 心脏彩超显示各组实验兔心尖四腔心切面图Figure 3 Doppler echocardiography shows the apical four-chamber view of each group

2.5 左心室心衰标志物水平变化

TAC术后8周，通过实时荧光定量PCR检测手术组和假手术组实验兔左心室心衰标志物mRNA的转录水平。手术组NT-proBNP和β-MHC mRNA相对表达量分别为（1.33±0.15）和（1.02±0.07），假手术组分别为（0.65±0.04）和（0.38±0.03）。手术组和假手术组相比，NT-proBNP和β-MHC mRNA相对表达量均显著升高（P＜0.05，图4）。

图4 横向主动脉缩窄（TAC）术后8周实时荧光定量PCR测定实验兔左心室心衰标志物水平变化Figure 4 Changes in the contents of left ventricular heart failure markets 8 weeks after TAC detected by realtime quantitative PCR

2.6 病理组织学结果

HE染色结果显示，TAC术后8周，假手术组实验兔的心肌细胞排列规则整齐，细胞大小正常，较少存在细胞外间质；手术组实验兔的心肌细胞排列松散，细胞横径增加，间隙增宽（图5A）。

同时，Masson染色结果显示，假手术组实验兔仅见少量胶原纤维存在于血管周围和心肌细胞之间；手术组实验兔心肌纤维疏松，胶原纤维含量增加，心肌大面积呈现蓝色（图5B）。

图5 手术组及假手术组实验兔心肌组织的HE染色与Masson染色Figure 5 HE staining and Masson staining of experimental rabbit myocardial tissues in the operation and sham-operation groups

3 讨论

本实验通过TAC术致兔主动脉弓缩窄，成功建立了兔心力衰竭模型。手术组实验兔在TAC术后8周出现明显的不可逆的充血性心力衰竭，符合临床上后负荷增加所致充血性心力衰竭的病理表现［14-15］。应用心脏超声检测降主动脉缩窄处血流速度，发现手术组降主动脉流速较假手术组明显升高，手术组实验兔存在明显的主动脉弓缩窄。通过超声检测证明，TAC术成功造成了实验兔降主动脉缩窄，结果准确且重复性好。

通过超声观察到手术组的升主动脉弓内径和室壁厚度相较于假手术组明显增加，符合由于降主动脉缩窄所致心脏后负荷增加的病理生理改变。TAC术后4周及8周时的心脏超声指标显示，较假手术组相比，手术组实验兔均表现出明显的心脏扩大。具体表现在以下方面：衡量心脏功能的指标LADd、LVEDd、LVEDs均明显升高，反映了实验兔心力衰竭时存在心脏扩大。二维超声心动图也证实实验兔心力衰竭中存在心脏扩大。手术组中反映心脏收缩功能的超声指标LVEF则明显下降，表明实验兔存在心脏因后负荷过重导致的心功能下降。之前的研究中，通过结扎兔腹主动脉发现，8周时出现心肌肥厚和心力衰竭［16］。综上所述，心脏超声能够完整准确地采集心力衰竭兔的心脏扩大指标和心功能指标，为诊断实验兔心力衰竭提供了可靠的依据。

有研究通过兔腹主动脉缩窄联合静脉肾上腺素输注，成功诱导了充血性心力衰竭模型，于术后8周观察到手术组兔超声心动图发生明显异常［17］。腹主动脉是主动脉弓血液的主要流出道，腹主动脉缩窄也能导致充血性心力衰竭的发生；这与本研究结果一致。有研究表明，小鼠主动脉缩窄所致的心力衰竭模型中，通过超声观察到的心力衰竭指标LVEDd仅在第18天以后出现明显升高，而第9天并未出现明显升高［18］，即在术后第3周左右开始出现明显的心力衰竭改变。但在本研究中，术后4周时超声心动图指标改变不明显，术后8周才出现明显的心力衰竭改变；这或许与小鼠属于小型动物，其心脏对后负荷耐受较差有关。

研究表明，NT-proBNP的来源主要是心室，心室扩张和压力负荷的增加是促进NT-proBNP释放的主要因素，因此NT-proBNP常被用作评价心功能不全的标志物，用于心力衰竭的临床诊断及疗效评价［19］。β-MHC表达的增加会加重心肌病理性重构，导致心力衰竭的进展［20］。本研究用NT-proBNP和β-MHC评价实验兔主动脉弓缩窄所致心力衰竭的可靠性。结果显示，相较于假手术组，手术组实验兔的T-proBNP和β-MHC水平在手术后8周时明显升高，证实部分TAC致实验兔心力衰竭的模型是可靠的。同时，手术组实验兔心脏病理学组织切片显示：TAC术后8周心肌细胞横径增加，肌纤维疏松，胶原纤维含量增加，与超声心动图中心肌回声增强、心腔呈离心性扩大的结果相一致，也进一步证实了TAC术能够通过增加实验兔心脏后负荷诱导其产生心力衰竭。

本研究的局限性在于未对兔主动脉弓缩窄程度做分级，也未采用不同的术式进行对比，故未能观察到不同主动脉弓缩窄程度对疾病进展程度的影响。另外，实验中超声只观察了术后4周及8周时（即心力衰竭中晚期）的心功能指标，未能完整地观察到实验兔从TAC术后到心力衰竭整个过程的变化。因此，后续的研究有必要观察实验兔TAC术后早期的指标（如1周、2周），并选择不同程度的缩窄术式，以便更严谨地探讨主动脉弓缩窄程度与心力衰竭发生的关系，明确TAC术建立兔心力衰竭模型的可行性及心脏超声的评估作用。

常规TAC术式在无名动脉和左侧颈总动脉之间结扎。本研究采用的TAC术式为非常规术式，即在主动脉弓向降主动脉延续的位置结扎。由于主动脉弓发出的分支血管较多，在分离血管时难度较大，虽然在预实验时尽量分离主动脉鞘，但是最终实验效果未达到预期。另外，在预实验中发现，选择在无名动脉和左侧颈总动脉之间结扎的方式，兔的死亡率较高。因此，为了更好地剥离主动脉鞘和分离结扎血管，本研究选择在主动脉弓向降主动脉延续的位置进行结扎。两种结扎方式在兔心力衰竭模型构建中的差别，以及对结果有无影响，还需在后续研究中加以探讨。

综上所述，本研究应用TAC术建立实验兔心力衰竭模型是有效且可行的，在TAC术后8周时兔心肌出现失代偿反应，形成不可逆的心力衰竭。TAC术后通过心脏超声评价实验兔心功能及主动脉弓缩窄程度，可以准确判断心力衰竭模型是否成功，并能观察其发展过程中的心脏形态学及心功能变化。

[医学伦理声明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有动物实验均已通过昆明市延安医院实验动物伦理委员会审查批准（No.2014117）。所有实验过程均遵照中国实验动物相关法律法规条例要求进行。

All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Kunming Yan'an Hospital(Approval Letter No.2014117).All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,including the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892-2018),and so on.

[作者贡献Author Contribution]

罗庆祎负责实验设计及论文写作；章体玲参与动物实验及数据采集；丁云川参与动物实验及数据采集；陈剑参与数据采集与数据分析；赵丽参与动物实验；王庆慧负责课题和本论文的审核及把关。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。