缫丝水对老龄大鼠氧化应激水平的改善作用

覃辉艳,陈华凤,杨 慧,罗海兰,傅伟忠,李庆波,张洁宏

(广西壮族自治区疾病预防控制中心,南宁 530028)

缫丝水是蚕茧加工成生丝过程中缫丝工序（蚕茧通过煮茧将茧丝脱去大部分丝胶）产生的废水，每生产1 000 kg生丝将产生550～950 m3缫丝水［1］。缫丝水主要成分为丝胶和蚕蛹蛋白，含大量氮、磷等物质，若直接排放，会使周围水体在短时间内迅速富营养化，导致水体腐败变质、发黑变臭，引起严重环境污染［2］。缫丝厂废水处理主要有物理化学法和生物化学法，但两者均成本较高且存在产生二次废物的问题，达不到资源节约与可持续发展的要求［3］。若能对其进行回收利用，不仅大大降低生产企业的废水治理成本，且对环境保护和资源的循环利用具有重要意义。

目前对缫丝水回收利用的研究主要侧重于从缫丝水中回收丝胶蛋白的工艺和方法，减少废水的主要污染物质蛋白质的含量，并对其进行有效利用以增加蚕茧的产品附加值，其间的废水处理费用转化为新产品的生产成本。以往的研究表明，蚕丝可能是导致人类致敏的过敏原，缫丝工人在加工蚕丝的工程中，皮肤常暴露于蚕丝，其对丝质过敏原的敏感率较高［4］。但是前期研究发现缫丝水经口无毒副作用［5］，且具有增强人体免疫力［6］和降血脂［7］的作用，具有开发成为功能性新食品原料的可能。目前研究显示，丝胶多肽具有2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基清除活性［8］，丝胶还可以抑制酪氨酸酶活性，并对过氧化氢和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼有明显的清除作用［9］。

本研究模拟传统缫丝工艺制备缫丝水，研究其对老龄大鼠氧化应激的改善作用，为缫丝水的开发利用和人口老龄化相关重大疾病的预防控制提供重要的科学依据和研究数据支撑。

1 材料与方法

1.1 缫丝水样品制备

本实验使用的商业干蚕茧由广西产品质量检验研究院提供。实验前模拟传统缫丝水产生过程进行样品处理：将蚕茧去除蚕蛹，称量100 g除蛹蚕茧加水至3 L，浸泡0.5 h后小火煮沸1 h，其间不添加任何化学添加剂，用纱布过滤分离，以同样方法重复提取一次，最后将两次的滤液合并，旋转蒸发仪减压浓缩至1 000 mL，得到0.1 g/mL浓缩液，置于4℃冰箱保存，并按照食品安全国家标准对其进行成分检测，临用前再用纯水配制。根据实验需要，使用同批次蚕茧，严格按相同的制备方法、设备和工艺多次进行样品制备，以保证样品质量的一致性和新鲜度。

1.2 实验动物及环境

SPF级16月龄雄性SD大鼠40只，体质量（856.0±103.7）g，由广西医科大学医学实验动物中心提供［SCXK（桂）2014-0002］，实验动物质量合格证号为45000300000915。动物饲料由北京科澳协力饲料有限公司［SCXK（京）2014-0010］提供。动物实验室为屏障系统［SYXK（桂）2016-0002］，温度22～25℃，相对湿度55%～70%。动物实验方案经过广西壮族自治区疾病预防控制中心实验动物管理与伦理委员会审查批准，审查批号为20190004。

1.3 剂量选择与样品溶液配制

设500、250、125 mg/kg体质量3个剂量组［6-7］，同时设一个阴性对照组，每组10只动物。分别量取样品浓缩液50.0、25.0、12.5 mL，加纯水至100 mL，混匀，配成50.0%、25.0%、12.5%浓度的高、中、低剂量组样品溶液。

1.4 仪器与试剂

TECAN M200 PRO全自动酶标仪（奥地利TECAN公司）；IKA RV10旋转蒸发仪（德国IKA公司）；Sigma 4-16K高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）；日立L-8500A氨基酸分析仪（日本日立公司）；海能D100杜马斯定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）。

丙二醛（malonaldehyde，MDA）、蛋白质羰基、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化物酶（catalase，CAT）和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.5 缫丝水成分分析

缫丝水成分检测按照食品安全国家标准［10-11］进行。将受试样品5 g溶于15 mL的6 mol/L HCl（质量体积比为1:3），再加入0.2 mL苯酚，抽真空，在110℃恒温干燥箱中水解22 h，使用日立L-8500A氨基酸分析仪进行游离氨基酸和水解氨基酸分析。使用海能D100杜马斯定氮仪进行蛋白质检测。

1.6 动物实验

参照国家食品药品监督管理局发布的国食药监保化［2012］107号《关于印发抗氧化功能评价方法等9个保健功能评价方法的通知》［12］的附件1——抗氧化功能评价方法。受试老龄大鼠在屏障设施内喂养观察7 d，未见异常后取血测MDA含量。根据血清MDA含量将大鼠分层随机分为3个受试样品剂量组和1个阴性对照组，每组10只，并适当调整，使各组的氧化水平和平均体质量尽可能均衡。3个剂量组按照大鼠体质量每100 g灌胃1.0 mL缫丝水的用量，分别经口给予相应浓度的样品溶液；阴性对照组给予等体积的纯水。每天灌胃一次，连续灌胃30 d，并每周称体质量1次，根据体质量调整灌胃量。

实验结束时大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，取血和肝、脑组织，按照试剂盒方法测定脂质氧化产物MDA含量、蛋白质羰基含量、GSH含量和抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）活性。

1.7 实验数据统计

采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。计量资料以平均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，组内两两比较采用Dunnett法，ɑ=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 缫丝水成分分析

缫丝水（0.1 g/mL浓缩液）中粗蛋白含量为1 640 mg/100 g，游离氨基酸含量为18 mg/100 g，水解氨基酸含量为1 700 mg/100 g。丝氨酸（30.59%）、门冬氨酸（18.82%）、甘氨酸（10.00%）和苏氨酸（8.24%）是缫丝水中主要的水解氨基酸。色氨酸和牛磺酸含量均低于检测限值（＜1.3 mg/100 g）（表1）。

表1 缫丝水氨基酸成分Table 1 Amino acid compositions of silkworm cocoon water

2.2 缫丝水对大鼠体质量的影响

实验前和实验结束时缫丝水样品各剂量组的大鼠体质量与阴性对照组均无明显差异（P＞0.05），表明该样品对老龄大鼠的体质量无明显影响（表2）。

表2 实验期间各组老龄大鼠的体质量Table 2 Body weight of rats in each group during the experiment(±s)

表2 实验期间各组老龄大鼠的体质量Table 2 Body weight of rats in each group during the experiment(±s)

注：表中各时期各组大鼠的体质量及增质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。Note：There were no significant differences in body weight at different time points,and weight gain in each group(P＞0.05).

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2.3 缫丝水对大鼠血清及组织脂质氧化产物MDA和蛋白质羰基含量的影响

实验前各组大鼠血清MDA含量无明显差异（P＞0.05，图1A）。实验终末，缫丝水样品高剂量组大鼠的血清、脑和肝组织MDA含量，以及中剂量组大鼠的血清MDA含量均低于阴性对照组（P＜0.05），表明该样品具有降低老龄大鼠血清和组织中过氧化脂质含量的作用（图1A～D）。

实验终末，缫丝水样品高剂量组的血清和脑组织、中剂量组的脑组织蛋白质羰基含量均低于阴性对照组（P＜0.05），表明该样品具有降低老龄大鼠血清和组织中蛋白质羰基含量的作用（图1E～G）。

图1 缫丝水对老龄大鼠血清和脑、肝组织中MDA和蛋白质羰基含量的影响Figure 1 Effects of silkworm cocoon water on MDA levels and carbonyl contents in the serum，brain and liver of rats

2.4 缫丝水对大鼠血清及组织中GSH含量和GSH-Px活性的影响

实验终末，样品各剂量组的血清GSH含量和高、中剂量组的脑组织GSH含量均高于阴性对照组（P＜0.05），表明该样品可以提高老龄大鼠血清和脑组织中谷胱甘肽的含量（图2A～C）。

实验终末，样品高剂量组的血清、脑及肝组织和中剂量组的脑组织中GSH-Px活性均高于阴性对照组（P＜0.05），表明该样品可以提高老龄大鼠血清和脑、肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶的活性（图2D～F）。

图2 缫丝水对老龄大鼠血清和脑、肝组织中GSH含量和GSH-Px活性的影响Figure 2 Effects of silkworm cocoon water on GSH levels and GSH-Px activity in the serum,brain,and liver of rats

2.5 缫丝水对大鼠血清及组织中SOD和CAT活性的影响

实验终末，样品高、中剂量组大鼠肝组织中SOD活性均高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明该样品可以提高老龄大鼠肝组织中超氧化物歧化酶的活性（图3A～C）。

实验终末，样品各剂量组大鼠肝组织中CAT活性和高、中剂量组的血清CAT活性均高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明该样品可以提高老龄大鼠血清和肝组织中过氧化氢酶的活性（图3D～F）。

图3 缫丝水对老龄大鼠血清及肝、脑组织SOD和CAT活性的影响Figure 3 Effects of silkworm cocoon water on SOD activity and CAT activity in the serum,brain,and liver of rats

3 讨论

氧化应激是指机体的氧化系统和抗氧化系统失衡，倾向于氧化，从而导致组织损伤。随着年龄增长，活性氧等自由基清除变慢，链式的自由基反应使得核酸、蛋白质和脂肪酸等大分子物质发生变性和交联，损伤细胞结构，导致生物体的氧化应激伤害，最终出现衰老［13］。氧化应激不仅与衰老密切相关，且对糖尿病、心血管疾病的发生发展起重要作用［14-15］。此外，高脂血症［16］、神经退行性病变［17］、阿尔茨海默病［18］、肿瘤等［19］疾病的发生发展都与体内氧化应激过度有关。

生物体内的抗氧化防御体系由酶促抗氧化体系（如SOD和CAT等）和非酶促抗氧化体系（如GSH等）组成，二者可以消除活性氧，减轻氧化应激损伤［20-21］。SOD可催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，CAT可催化过氧化氢分解成氧和水，而GSH-Px则能催化GSH变为氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进过氧化氢的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害［20］。MDA和蛋白质羰基则是脂质、蛋白质氧化产物，MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应的终产物，可引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，并具有细胞毒性［22］。蛋白质羰基是自由基攻击蛋白质而产生的一种不可逆的氧化修饰产物，可导致蛋白质的失活、水解、折叠和交联，进而影响蛋白质的功能和机体代谢［23］。二者均可反映机体的氧化应激损伤程度，是目前最常用的氧化产物标志物。研究表明，人体血液中的蛋白质羰基含量呈年龄相关性增加，蛋白质氧化与血浆抗氧化能力呈显著负相关［24］。MDA含量随年龄的增长而增多，而SOD和GSH-Px含量则随着年龄的增长而降低，且无性别差异，清除体内过多的氧化自由基有助于延缓机体衰老［25-26］。

本研究从脂质氧化产物（MDA）、蛋白质氧化产物（蛋白质羰基）、抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）和抗氧化物质（GSH）四个方面初步研究缫丝水改善老龄大鼠氧化应激的作用。结果显示：缫丝水可以降低老龄大鼠血清和组织中的脂质氧化产物MDA和蛋白质氧化产物蛋白质羰基含量，提高老龄大鼠血清和组织中抗氧化物质GSH的含量、血清和组织中抗氧化酶CAT和GSH-Px、组织中抗氧化酶SOD的活性，表明缫丝水可改善老龄大鼠的氧化应激。此外，实验结果显示：经口给予缫丝水后，大鼠脑组织中脂质、蛋白质氧化产物均降低，GSH-Px活性和GSH含量均明显增高，而SOD和CAT活性无明显升高，提示缫丝水对脑组织的氧化应激保护可能通过提高其非酶促抗氧化体系来实现。大鼠肝组织的脂质氧化产物含量降低，而SOD、CAT和GSH-Px活性均明显升高（P＜0.05），但GSH含量无明显增加（P＞0.05），提示缫丝水对肝组织的氧化应激保护可能通过提高其酶促抗氧化体系来实现。另外从本实验结果可以看出，无论在实验动物的血清还是组织中，脂质氧化产物和蛋白质氧化产物含量均随着缫丝水剂量的增加而下降，抗氧化酶和抗氧化物质含量均随着缫丝水剂量的增加而提高，提示缫丝水剂量越高，改善氧化应激的作用越好，且在一定剂量水平时才具有明显改善氧化应激的作用。然而考虑到缫丝水的安全性，其所用剂量不应超过其安全剂量；本课题组前期对其安全性研究发现，口服缫丝水90 d后雄性和雌性SD大鼠的未观察到有害作用剂量（no observed adverse effect level，NOAEL）为1 g·kg-1·d-1［5］。本研究所用缫丝水高剂量为NOAEL的1/2，提示在其安全剂量范围内，亦可表现出改善氧化应激的作用。

缫丝水主要成分为丝胶和蚕蛹蛋白［2］，本研究对其氨基酸成分分析显示，丝氨酸、门冬氨酸、甘氨酸和苏氨酸是缫丝水中主要的水解氨基酸。这一结果与其他研究者对蚕丝中丝胶蛋白氨基酸组成分析的结果相似［27］。近年的研究显示，丝氨酸、甘氨酸均具有抗氧化应激的作用［28-30］。丝氨酸可通过激活腺苷酸活化蛋白激酶AMPK和调控GSH合成相关基因的表达拮抗大鼠高脂肪饮食引起的氧化应激［28］。丝氨酸能提高大鼠大脑中动脉栓塞后的脑内SOD活性，降低MDA［29］。而甘氨酸是体内GSH的组成氨基酸，可通过抑制糖尿病大鼠体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox4）的表达，增强GSH的合成，减轻肾脏氧化应激［30］。缫丝水中氨基酸种类丰富，其中的丝氨酸、甘氨酸可能在抗氧化过程中发挥了重要的作用，其作用机制有待进一步研究。

[医学伦理声明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有动物实验均已通过广西壮族自治区疾病预防控制中心实验动物管理与伦理委员会审查批准（No.20190004）。所有实验过程均遵照中国实验动物相关法律法规条例要求进行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Welfare and Ethics Committee of Guangxi Center for Disease Control and Prevention(Approval Letter No.20190004).All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,includingAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892-2018),and so on.

[作者贡献Author Contribution]

覃辉艳收集资料，设计研究方案，分析数据，撰写论文；陈华凤开展样品制备及参与抗氧化指标检测；杨慧负责成分分析检测；傅伟忠和罗海兰负责抗氧化指标检测；李庆波负责实验动物灌胃及观察；张洁宏指导整个实验研究及论文审核。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。