基于微卫星标记的南白犀亲子鉴定

王予辰 陈 莹 王 宇* 金 煜*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.云南石林龙晖野生动物科研中心有限公司，石林，652200)

奇蹄目(Perissodactyla)犀科(Rhinocerotidae)共4属5种，即黑犀(Dicerosbicornis)、白犀(Ceratotheriumsimum)、印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rh.sondaicus)和苏门答腊犀(Dicerorhinussumatrensis)，都处于濒危状态，被列入CITES附录Ⅰ，仅南白犀(Ceratotheriumsimumsimum)被列入附录Ⅱ。白犀历史上在整个南部非洲草原均有分布[1]。20世纪初，南非白犀种群遭到殖民者的大量屠杀，仅有约100头存活在南非东海岸的一小块区域[2]，后虽从灭绝边缘恢复，但一直受盗猎、栖息地破碎丧失和犀牛制品非法国际贸易等因素影响处于受危状态。

犀牛生殖需经历4～6周的发情期、16个月的妊娠期和1～6个月的哺乳期，总周期1.5～2.0年，是陆生哺乳动物最长的生殖周期之一[3]。白犀野外繁殖率相对较低，主要受限于繁殖生物学的特性以及环境波动等；人工繁育生产率有所提高，借助观察各种产前变化、血清孕酮含量、不同产程和胎儿情况等帮助诊断难产和围产期并发症，可以减少生产过程中的死亡率，提高种群的出生率[4-5]。

南非殖民时期的遭遇使南白犀的遗传变异性比其他种的犀牛都要低[6]，由于缺乏分散的机会，小而孤立的种群在近亲间繁殖的风险特别大，需要对种群交配系统具有广泛和持续的了解，以确定近亲繁殖可能造成的风险，因此详细准确的谱系记录对于南白犀的种群发展至关重要。种群的迁移易位以及多雄交配使得真实父权难以通过观察得到[7]，利用微卫星分子标记进行亲子鉴定可以很好地解决这一问题，为种群的所有个体提供准确的谱系信息，实行最佳的管理和保护。

本研究以110头人工半散放南白犀为研究对象，筛选出13个多态性好且可靠性高的微卫星位点，利用相关软件计算其遗传多样性和累积排除概率，分析这些位点用于南白犀亲子鉴定的可行性，给出位点联合使用方案。选用4组双亲本已知三联体组合对研究结果进行验证，在此基础上，对2只父系不清幼体的生物学父亲进行了确认，以期确定选用的微卫星位点组合在实际应用中的有效性。

1 材料与方法

1.1 样本采集

群体为人工半散放非洲南白犀，共110头，样本为静脉血，于2020年12月23日在石林龙晖野生动物科研中心采集。

1.2 基因组DNA提取及检测

用Axygen公司Blood Genomic DNA Miniprep Kit 250-prep试剂盒提取血液样本基因组DNA，利用德国Implen NanoPhotometer-N50超微量分光光度计检测DNA浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.3 引物筛选和PCR扩增

查阅文献获得26对犀牛的微卫星引物[8-12]；依据NCBI所载非洲南白犀全基因组序列，使用SSRHunter查找微卫星重复序列，自行设计30对引物(BX1～BX30)。全部引物由北京擎科生物科技有限公司合成，通过琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增出产物。扩增体系(总体积20.0 μL)：10.0 μLTaqMaster Mix酶，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50～62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。

1.4 引物的荧光标记和毛细管分型

在引物5′端用FAM荧光基团修饰(北京擎科生物科技有限公司)，扩增产物通过毛细管电泳测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，运用GeneMapper 4.0软件，以LIZ-500为标准内参，进行基因分型，获得相应位点的长度多态信息。

1.5 数据处理及微卫星位点组合筛选

使用POPGENE软件计算各位点的等位基因数、杂合度和多态信息含量，并对各位点进行MicroChecker检验和哈温平衡(Hardy-Weinberg)检测。利用Cervus 3.0软件计算每个位点在2个亲本基因型未知、1个亲本基因型已知和2个亲本基因型已知情况下的非父排除概率及累积非父排除概率，确定最适用于南白犀亲子鉴定的微卫星位点组合方案。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性及MicroChecker检验

56对引物的扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，有32对引物扩增出目的条带(表1)。通过毛细管电泳检测后发现DB5、DB14、DB23、DB30、IR22、SR74、BX10、BX21和BX23位点的等位基因数只有1个，余下的23个位点经过MicroChecker检验后发现有10个位点存在无效等位基因和等位基因缺失的情况，故实际仅有13个位点可用于后续的亲子关系分配(表2)。

续表1

表2 MicroChecker筛选的可用于南白犀亲子关系分配的位点

供试群体共检测出37个等位基因，其中BX1的等位基因数目最多，为5个，DB1、AY138545、BX2、BX26和BX29等位基因数目最少，均为2个。各位点在群体中的观察杂合度(Ho)为0.036～1.000，平均值为0.511；期望杂合度(He)为0.053～0.759，平均值为0.482。根据Botstein等[13]的PIC分类标准，共检测到4个高度多态位点(PIC>0.500)，6个中度多态位点(0.250

表3 南白犀13个微卫星位点多态性

2.2 非父排除概率和累积非父排除概率

2.2.1 非父排除概率

13个位点的非父排除概率计算结果：PE-1P值为0.001～0.351，PE-2P值为0.026～0.530，PE-PP值为0.050～0.712。BX1位点的多态信息含量最高，其PE-1P、PE-2P、PE-PP的值也最高；BX29位点多态信息含量最低，其PE-1P、PE-2P、PE-PP的值也最低，即PE-1P、PE-2P、PE-PP值随PIC的降低而降低(表4)。

表4 南白犀13个位点的平均排除概率

2.2.2 累积非父排除率

将13个位点根据多态信息含量(PIC)由高到低排列，将其作为位点组合的依据，依次计算位点数目从1增加到13时的联合排除概率。结果显示：随着联用位点数的增加，联合排除概率随之增高；三联体亲子鉴定中，微卫星位点数达到13时，联合排除概率CPE-PP的值超过99%(表4)。

2.3 种群实测与效果评价

根据表4可知在CPE-PP的情况下，采用的13个微卫星位点的累积非父排除率可达到99%以上，利用这些位点对4组共12头具有谱系记录的南白犀进行亲子鉴定分析，包括子代4头、母本4头和父本4头，计算每个子代父亲的LOD值来验证所选取的微卫星位点组合的准确性。

在2个亲本基因型已知的情况下，计算4个父本的LOD值，F-01、F-02和F-04的LOD值均达到95%的严格置信度(表5)。Cervus分配的最似父本与谱系记录一致，所选用的13个微卫星位点组合适于在2个亲本基因型已知的情况下确定亲生父本。

表5 南白犀13个微卫星位点组合的LOD值

表6 南白犀亲子鉴定结果

在只有母本基因型清楚的情况下，利用该微卫星位点组合对2个父本不清的子代进行亲子鉴定，C-01的3个候选父亲中，F-04和F-06存在的错配位点过多，未计算出LOD值；F-05的LOD值达到95%的严格置信度，鉴定为C-01的亲生父亲。C-02的2个候选父亲中，F-07也因错配位点过多未计算出LOD值，亲生父亲经鉴定为F-03。

3 讨论

3.1 分型的可靠性

现有的关于犀牛的微卫星标记大部分都是二碱基重复序列，在DNA复制过程中极容易出现引物或模板滑脱，滑动链与互补链碱基错配，形成影子带。在毛细管分型图谱中，影子带通常比等位基因少一个或多一个重复单元，形成的影子峰紧挨着主峰，特别是对杂合子个体而言极易造成分型错误。为了减少按DNA分子质量测定值计算等位基因DNA片段长短所产生的误差[14]，选用四碱基重复序列可得到更准确的基因分型结果。通过NCBI查找南白犀的全基因组序列，设计了多对四碱基微卫星引物，结果显示影子带出现频率极低，便于判读基因分型结果。

采用微卫星标记分析亲子关系时，无效等位基因的存在会直接影响亲本分析结果，Dakin等[15]研究发现多个位点存在无效等位基因，且频率较高时，会造成亲本分析结果的混乱和错误，故本研究所有位点利用MicroChecker剔除存在无效等位基因的位点，保证后续分析结果的可靠性。

3.2 位点的多态信息含量

每个位点的等位基因数量不仅是衡量遗传变异的指标，也是实现高亲本分配率的重要因素，DB52和DB1位点是专门为黑犀设计的，本研究中检测出的等位基因数量同Brown等[9]的研究相比数量较少，与Nielsen等[8]的相同，因此在跨物种研究中使用这2个位点时无法提供相同水平的多态信息含量。AY138541、AY138542、AY138544和AY138545位点是专门为南白犀设计的，但由于群体不同，导致等位基因数量同Florescu等[16]的相比较少，因此专门新设计了7个微卫星位点，可提供较多的等位基因数量和多态信息含量。

根据本研究确定的遗传参数，发现遗传多样性水平并不像历史瓶颈所预期的那样低，本研究中描述群体杂合度的参数平均值，如Ho、He比其他南白犀基因研究中发现的参数平均值略高。微卫星标记在其他南白犀研究中估计的平均Ho为0.435～0.478[6，17-19]，而本研究的平均Ho为0.511，这可能是由于混合先前分离的小种群产生的效应，如在纳米比亚的一个南白犀种群中，F0和F1动物的杂合度高于F2，因为F0是从不同地方迁移的[6]。

进行亲子鉴定时，应选用符合Hardy-Weinberg平衡的微卫星位点，但是只有当一个大的孟德尔群体内的个体间进行随机交配，不存在选择、突变和迁移等情况时[20]，该群体的微卫星位点才处于平衡。现有南白犀的微卫星标记数目有限，且选用的试验群体为半散放人工养殖群体，群体内奠基者效益较严重，为了充分利用遗传信息，故将偏离Hardy-Weinberg平衡的位点也全部应用进来。

3.3 亲子鉴定的有效性和可靠性

由于白犀的遗传多样性较低，对于南白犀的父权认定大都采用三联体，但是有些在亲子分配方面并不能达到100%严格置信。Coutts[17]试图在2个南白犀种群中确定父权，2个种群都有10头小牛和12个候选父亲，分析表明，每个种群仅有1头小牛能达到95%严格置信；Kim[21]也利用微卫星标记对黑犀种群进行亲子关系研究，6头小牛有2只达到了95%的严格置信，与Coutts[17]相比其候选父亲数量很少，为2～5个。Garnier等[22]能够明确地为一个小野生黑犀种群(n=33)的19个后代指定亲缘关系，选用的10个微卫星位点排除概率为0.593～0.999，双亲基因型已知时的联合排除概率达到了0.999。本研究选用的13个微卫星位点排除概率在0.050～0.712，双亲基因型已知时的联合排除概率达到了0.998，选用的4头小牛最似父亲分配均达到严格置信，位点排除概率相对较低的主要原因可能是黑犀种群的遗传多样性比白犀种群高[1]，故选用排除率高的位点组合进行亲子关系分析时可靠性会显著提高。

复合扩增虽然可以有效提高等位基因分型效率，尤其是从毛发等非损伤性材料中提取DNA用于试验，但是本研究选用的13个微卫星位点等位基因长度相似，这导致在同一个体系中无法使用一种荧光基团扩增多个位点，在同一体系中荧光基团数量过多可能出现相互抑制的情况，故均采用FAM荧光基团进行修饰。犀牛人工繁育和野外最易获得的是粪便，因此本方法适用性仍然比较广泛，只是分析成本相对较高。