不同发酵条件下萝卜泡菜生物胺变化规律研究

陈露，马良，谭红霞，朱文优，曾鹏，尹礼国*

(1.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；2.宜宾学院 农林与食品工程学部，四川 宜宾 644000；3.西南大学 食品科学学院，重庆 400715)

泡菜是利用有益微生物对新鲜蔬菜进行加工而制得的一种发酵蔬菜。在泡菜发酵过程中，由于原辅料、发酵方式、地域环境等存在差异，被分为榨菜、泡菜、酱菜等不同种类[1-2]。我国泡菜发展历史悠久，其中，极具代表性的是四川泡菜。据报道，四川泡菜年产量约占我国泡菜年产总量的70%[3]。四川泡菜主要以新鲜蔬菜或特殊的动物肉类为原料，选择性添加生姜、大蒜、辣椒等辅料，然后经食盐水泡渍发酵加工而成[4-5]。泡菜中富含维生素、膳食纤维、有机酸、益生菌、氨基酸等多种有益成分[6]。此外，泡菜还具有多种功能活性。相关研究表明，泡菜具有抗动脉硬化、抗氧化、降血压、抗衰老、降胆固醇、抗过敏、抗癌等多种功效[7-9]。

近年来，随着泡菜加工产业的发展，其生产规模已由家庭作坊式小型化生产发展为大规模工业化生产。加之其风味独特、口感脆嫩清香，已成为主要的调味料或下饭菜，并越来越受欢迎[10]。然而，传统自然发酵生产的工业化泡菜常出现生物胺等有毒有害物质污染的问题。生物胺是一组具有生物活性的低分子量碱性含氮有机化合物，主要包括组胺、酪胺、腐胺和尸胺[11-12]。研究发现，若摄入过量生物胺，会引起偏头痛、腹部痉挛、恶心、头痛、呕吐、皮疹、高血压等不良反应和疾病。在非常严重的情况下，会引起心慌、脑出血甚至是死亡[13]。当存在亚硝酸盐时，生物胺可以充当致癌的N-亚硝胺的前体，从而诱导具有致癌性的亚硝胺的形成，对人体造成毒害作用[14]。

目前，关于泡菜食品中亚硝酸盐的报道较多，而对于生物胺的研究相对较少[15]。蔬菜发酵离不开微生物的作用，而在此过程中，一些微生物能够诱导氨基酸脱酸产生生物胺[16]。因此，发酵蔬菜会不可避免地受到生物胺的污染。本文以我国传统自然发酵泡菜为研究对象，主要研究不同发酵条件下泡菜中生物胺的污染情况，分析得出泡菜在不同发酵工艺(温度、时间、盐浓度)下生物胺的变化规律，旨在探寻泡菜中生物胺含量较低、品质较好的工艺条件，以提高泡菜食品的安全性。同时，为泡菜等传统发酵食品中生物胺含量变化规律的研究和品质调控提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的白萝卜(无明显损伤和病虫害)、食盐、白砂糖、干辣椒：皆购自宜宾市翠屏区蓉戎超市；腐胺(putrescine，Put，纯度≥98%)、尸胺(cadaverine，Cad，纯度≥98%)、组胺(histamine，Him，纯度≥98%)、酪胺(tyramine，Tym，纯度≥98%)等标准品：美国Sigma-Aldrich公司；盐酸、氢氧化钠、高氯酸、碳酸氢钠、氨水(均为分析纯)：成都市科龙化工试剂厂；丹磺酰氯标准品(纯度>99%)：上海麦克林生化科技有限公司；超纯水：美国Millipore公司；乙腈(色谱纯，纯度≥98%)、甲醇(色谱纯，纯度≥98%)：美国Honeywell公司；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000高效液相色谱仪、反相HPLC色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) 美国ThermoFisher Scientific公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；KQ-50超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；QL-901 Vortex旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；JA3003B电子天平 上海精天电子仪器有限公司；NK200-1B可视氮吹仪 常州朗越仪器制造有限公司；HPX-9162MBE电热恒温培养箱 上海圣科仪器设备有限公司；HH-4数显恒温搅拌水浴锅 上海新诺仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同发酵时间下泡菜的制作方法

将新鲜白萝卜清洗干净，晾干，然后切成长、宽、高分别为4，3，2 cm的块状，装入5 L的泡菜坛中，再分别加入一定量洗净并晾干的干辣椒(3%，以萝卜质量计)和白砂糖(3%，以萝卜质量计)，并将坛中的材料压紧；然后向泡菜坛中加入食盐水(冷开水配制)，加至坛沿处，菜和盐水的质量比为1∶2，控制盐浓度为盐水总质量的4%。保证食盐水淹没蔬菜，控制盐水离坛口3～5 cm的距离。然后将坛沿加水密封，随后置于25 ℃的恒温培养箱中发酵，分别于第1，3，5，7，9，11，13，15天测定泡菜中生物胺含量。

1.3.2 不同发酵温度下泡菜的制作方法

将新鲜白萝卜清洗干净，晾干，然后切成长、宽、高分别为4，3，2 cm的块状，装入5 L的泡菜坛(准备4组，从A～D编号，每组3个平行)中，再分别加入一定量洗净并晾干的干辣椒(3%，以萝卜质量计)和白砂糖(3%，以萝卜质量计)，并将坛中的材料压紧；然后向泡菜坛中加入食盐水(冷开水配制)，加至坛沿处，菜和盐水的质量比为1∶2，控制盐浓度为盐水总质量的4%。保证食盐水淹没蔬菜，控制盐水离坛口3～5 cm的距离。然后将坛沿加水密封，随后分别置于20，25，30，35 ℃的恒温培养箱中发酵。待发酵时间为15 d时，分别对不同发酵温度下泡菜样品中生物胺含量进行测定。

1.3.3 不同发酵盐浓度下泡菜的制作方法

将新鲜白萝卜清洗干净，晾干，然后切成长、宽、高分别为4，3，2 cm的块状，装入5 L的泡菜坛(准备4组，从A～D编号，每组3个平行)中，再分别加入一定量洗净并晾干的干辣椒(3%，以萝卜质量计)和白砂糖(3%，以萝卜质量计)，并将坛中的材料压紧；然后向泡菜坛中加入食盐水(冷开水配制)，加至坛沿处，菜和盐水的质量比为1∶2，分别控制1～4号泡菜坛中盐浓度分别为盐水总质量的2%、4%、6%和8%，保证食盐水淹没蔬菜，控制盐水离坛口3～5 cm的距离。然后将坛沿加水密封，随后将所有的泡菜坛置于25 ℃的恒温培养箱中发酵。待发酵时间为15 d时，分别测定不同盐浓度下发酵泡菜样品中生物胺含量。

1.3.4 泡菜样品前处理方法

样品前处理参照Fong等[17]的方法并稍作修改，准确移取2.0 g分别在不同条件下发酵的泡菜样品，用研钵研碎后，转移至10 mL离心管中，加入6 mL 0.4 mol/L的高氯酸溶液，涡旋混匀5 min，超声15 min。静置后，在4 ℃下以 8000 r/min的转速离心15 min，将上清液转移至50 mL离心管中，向剩下的固体提取物中加入4 mL 0.4 mol/L的高氯酸溶液，在4 ℃下以 10000 r/min的转速离心10 min，合并两次提取液。

1.3.5 泡菜样品衍生方法

样品的衍生和检测参照Fong等的方法并稍作修改。准确移取2 mL上述提取液至10 mL具塞试管中，依次加入200 μL 2 mol/L氢氧化钠溶液、600 μL饱和碳酸氢钠溶液、4 mL 10 mg/mL丹磺酰氯衍生剂，然后盖塞，在40 ℃下避光反应45 min。反应结束后加入200 μL氨水终止反应，静置30 min，加入3 mL乙腈至总体积为10 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，供液相色谱测定。

1.3.6 标准溶液的配制

准确称取腐胺、尸胺、组胺、酪胺标准品各0.0015 g(精确至0.0001 g)分别于1.5 mL棕色瓶中，用1.5 mL的HCl溶液(0.1 mol/L)溶解，混匀，配制成质量浓度均为1.000 mg/mL的生物胺单标储备液，在-20 ℃下避光保存。随后将各单标储备液用HCl溶液稀释并配制成系列浓度的标准单标工作溶液。

1.3.7 高效液相色谱分析条件

色谱柱：反相HPLC色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A：超纯水；流动相B：乙腈；柱温：35 ℃；进样量：50 μL；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：254 nm。洗脱程序见表1。

表1 生物胺样品分离流动相梯度设置

1.3.8 生物胺线性实验、检测限及定量限分析方法

将生物胺混合使用液分别用0.1 mol/L的HCl溶液配制成0.001，0.01，1，5，25，50 μg/mL，经衍生后(衍生方法与1.3.5相同)，用高效液相色谱法进行测定。以生物胺浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作标准曲线，得线性方程。根据信噪比S/N≥3，得出检测限；根据信噪比S/N≥10，得出定量限。

1.3.9 泡菜感官品质分析方法

选择10名具备食品专业背景的非本项目组成员，组成评定小组，分别从色泽、香味、滋味、质地4个方面对不同发酵时间下的泡菜进行取样和感官评价，各项满分均为100分，具体见表2。

表2 感官评价表

1.3.10 数据统计与分析

使用Microsoft Excel 2019软件进行数据处理，并将数据结果以平均值±标准偏差的形式表示。采用 Origin 2018、Adobe Photoshop CS5.1和IBM SPSS Statistics 20.0进行图像绘制及数据处理。

2 结果与分析

2.1 生物胺标准曲线绘制

本文选择在0.001～50 μg/mL浓度范围内，对生物胺的峰面积与相应浓度进行线性回归，得到腐胺的线性回归方程y=3.8339x-0.1734(R2=0.9988)；尸胺的线性回归方程y=3.3828x-0.0520(R2=0.9996)；组胺的线性回归方程y=1.3161x-0.2168(R2=0.9996)；酪胺的线性回归方程y=0.2130x-0.0644(R2=0.9982)。线性相关系数大于0.99，说明线性关系良好。根据1.3.8中检测限和定量限的计算方法，得出腐胺、尸胺、组胺和酪胺的检测限均为0.001 μg/mL；定量限均为0.003 μg/mL。生物胺标准曲线图和液相色谱图分别见图1和图2，泡菜样品中生物胺液相色谱图见图3。

图1 生物胺标准曲线

图2 生物胺的高效液相色谱图

图3 泡菜样品中生物胺的高效液相色谱图

2.2 不同发酵时间下泡菜中生物胺动态变化情况

不同发酵时间下，泡菜中总生物胺含量动态变化情况见表3。

表3 不同发酵时间下泡菜中生物胺含量

由表3可知，在泡菜发酵过程中，腐胺和酪胺均呈现先逐渐升高后降低的趋势，且都在发酵第11天达到最高值，分别为(154.94±0.002) mg/kg和(56.04±0.039) mg/kg。组胺和尸胺则分别在第3天和第5天才检测到，且随着发酵时间的增加，它们的含量也逐渐增加，同样在第11天达到最高值，分别为(59.17±0.006) mg/kg和(11.13±0.003) mg/kg，此后逐渐降低。总生物胺含量先增加，在第11天达最大值(281.28 mg/kg)，然后稍有降低。从研究结果来看，泡菜中腐胺的平均含量最高(97.16 mg/kg)，其次是组胺(38.71 mg/kg)和酪胺(37.86 mg/kg)，尸胺的平均含量相对较低(7.68 mg/kg)。对于同一天发酵的泡菜样品，其腐胺的含量比其他3种生物胺的含量更高。腐胺含量更高的原因可能与泡菜发酵过程中生成鸟氨酸脱羧酶的微生物较为活跃有关。

在萝卜泡菜自然发酵初期，好氧菌(如肠杆菌属，Enterobacter)和酵母菌(Millerozymafarinosa)为优势菌群。在发酵中后期，乳酸菌成为优势菌群，包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)等[18-20]，这些微生物能够促进氨基酸脱羧，生成相应的生物胺[21]。其中，鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸和酪氨酸可分别在相应氨基酸脱酸酶的作用下生成腐胺、尸胺、组胺和酪胺，且精氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶分别作用于精氨酸和谷氨酸后形成鸟氨酸[22]。

研究发现，肠杆菌如阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、桑树肠杆菌(Enterobactermori)、酵母菌以及费斯莫尔德乳杆菌(Lactobacillusversmoldensis)、凝乳酶乳杆菌(Lactobacillusrennin)和短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)等具有较强形成腐胺的能力。因此，泡菜样品中高含量的腐胺可能与泡菜发酵过程中生成鸟氨酸脱羧酶的微生物较为活跃有关[23-24]。研究发现，希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)和肠杆菌能够分别作用于组氨酸脱酸酶和赖氨酸脱酸酶形成组胺和尸胺，而本研究中，在发酵第1天未检出组胺，而在前3 d均未检出尸胺，可能是由于能够产生这两种生物胺的相应微生物还未产生或产生数量较少[25-26]。 研究发现，乳酸菌对酪胺的形成有一定促进作用，而本研究中发酵第9天检测到酪胺的量比发酵第7天有了明显增加，可能与乳酸菌大量生成有关[27]。

2.3 不同温度下泡菜中生物胺含量变化情况

在不同温度下，泡菜中腐胺、尸胺、组胺和酪胺以及总生物胺的含量见表4。

表4 不同发酵温度下泡菜中生物胺含量

由表4可知，在发酵温度为20 ℃时，泡菜中总生物胺含量最高(105.58 mg/kg)，25 ℃时总生物胺含量最低。

对于不同种类的生物胺，腐胺是检出量最高的生物胺(最高检出量为49.22 mg/kg)，泡菜中腐胺的含量相对其他生物胺较高，可能是由于在本文研究的温度条件下，腐胺的前体物质——精氨酸的形成量较多[28]。此外，腐胺的最高检出量所在的温度为35 ℃。本研究结果与Cvetkovic等[29]研究的白菜泡菜在不同发酵温度下生物胺含量略有差异，他们研究发现腐胺是检出量最高的生物胺，但其在20 ℃下含量最高(48.02 mg/kg)，这可能是发酵原料不同，导致不同温度下泡菜发酵体系中菌群组成有差异，因而产胺能力不同。在所有温度下，腐胺的含量在24.75～49.22 mg/kg的范围内，酪胺的含量介于21.01～30.38 mg/kg之间。组胺和酪胺的含量在20 ℃时最高，分别为32.78 mg/kg和30.38 mg/kg。萝卜泡菜在35 ℃下发酵时生物胺含量较低，可能是由于该条件下温度相对较高，肠杆菌科和假单胞菌等易产生生物胺的微生物的生长受到抑制[30]。

2.4 不同盐浓度下泡菜中生物胺含量变化情况

不同盐浓度下泡菜中腐胺、尸胺、组胺、酪胺以及总生物胺的含量见表5。

表5 不同盐浓度下泡菜中生物胺含量

由表5可知，随着盐浓度的增加，总生物胺含量呈现逐渐降低的趋势，说明高盐浓度对生物胺有较好的抑制效果，尤其是当盐浓度增加到6%时，总生物胺含量显著降低(P<0.01)。已有研究表明，高盐主要通过降低氨基酸脱羧酶的活性，从而阻碍生物胺前体物质的生成[31]。

对于不同种类的生物胺，腐胺的总检出量最高，为147.48 mg/kg，且其最高检出量大于100 mg/kg，即将超过目前发酵蔬菜总生物胺的限量允许值(100～200 mg/kg)，因此存在较大风险。酪胺是检出量最高的生物胺，在含盐量为2%、4%和6%的情况下均有酪胺检出，可能是由于具有酪氨酸脱酸酶活性的微生物能够耐受较高浓度的盐[32]。当盐浓度为6%及以上时，未检出组胺，说明以希氏乳杆菌为主的产胺微生物对盐的耐受能力差[33]。当盐浓度为4%及以上时，均未检出尸胺，说明增大盐浓度能够很好地限制参与尸胺形成的微生物的表达能力[34]。

此外，相关研究发现，在盐浓度较高的条件下，部分耐盐菌能在一定程度上降解生物胺。Li等[35]研究发现，在盐浓度为12%的条件下，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)对尸胺、组胺和酪胺的降解率分别为33.44%、32.74%和39.93%。

2.5 感官评价结果与分析

在控制发酵温度(25 ℃)和盐浓度(4%)的条件下，采用打分法对不同发酵时间下泡菜样品的色泽、香味、滋味、质地等进行评分，具体评分结果见表6。

表6 不同发酵时间下泡菜感官评分

续 表

由表6可知，发酵第7天的泡菜总体感官评分最高。随着发酵的进行，泡菜的汁液从清亮逐渐变得浑浊，泡菜质地逐渐软化，硬度和脆度降低，酸味逐渐变得明显且不协调。但所有泡菜均无明显的馊味、霉味等不良风味，也未出现明显的苦味、涩味。尤其是发酵第7天的泡菜，其汁液仍然保持清亮，光泽度好且无肉眼可见的霉花浮膜现象，香味浓郁，滋味鲜美，具有泡萝卜特有的清香味，酸味和咸味协调柔和，同时，泡菜形态大小均一，组织紧密，质地较为脆嫩，未见明显菜屑。

3 结论与讨论

本文主要研究了不同发酵条件(包括发酵时间、温度、盐浓度)下，泡菜中生物胺以及泡菜感官品质的变化。研究发现，随着发酵时间的增加，泡菜中总生物胺的含量呈先逐渐升高后缓慢降低的趋势。在发酵时间相同的情况下，腐胺含量比其他3种生物胺的含量更高，这与发酵泡菜中含有大量与腐胺形成相关的微生物有关。目前，虽未对泡菜中腐胺进行明确限量，但其含量已超过150 mg/kg。由于腐胺会引起咳嗽、喘息、喉炎、气短、头痛、恶心、呕吐、低血压等症状，严重的会造成死亡。同时，腐胺还能与其他物质产生联合毒性，如与尸胺联合，会抑制肠道中二胺氧化酶和组胺-N-甲基转移酶的活性，并增强了组胺的毒性作用；与亚硝酸盐形成致癌物亚硝胺，因此，应引起足够重视。

对于不同温度下发酵的泡菜样品，目前的结果表明，在发酵温度为20 ℃时泡菜中总生物胺含量最高，而在25 ℃时总生物胺含量相对较低。虽然在35 ℃时总生物胺含量与25 ℃时相近，但考虑到高温条件下，泡菜质地更易变软，口感变差。因此，建议将发酵温度控制在25 ℃，在此条件下，泡菜的感官品质和安全性均较高。

对于不同盐浓度下发酵的泡菜，随着盐浓度的增加，总生物胺含量逐渐降低，说明增加盐浓度可在一定程度上抑制生物胺的积累。但由于高盐与当今倡导的低盐生活理念不符，而且高盐易导致高血压等一系列疾病[36]，因此，在低盐发酵条件下，获得低生物胺含量的泡菜是今后需要研究的方向之一。