雷公藤甲素通过CXCL10/CXCR3轴对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响研究

任强，邓俊，张沄，周进，王宋平

支气管哮喘（以下简称为哮喘）是由多种炎症细胞（嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等）和细胞因子〔白介素（interleukin，IL）等〕参与的气道慢性炎症性疾病［1］。抑制气道炎症细胞的浸润及细胞因子的表达是改善气道炎症、提高哮喘控制水平的主要措施，糖皮质激素是目前控制哮喘的主要抗炎药，但对于激素抵抗的哮喘患者则不能获得良好的控制效果，且长期使用糖皮质激素也可能产生骨质疏松、血糖升高等不良反应［2］。因此，寻找哮喘新的治疗方法仍然是目前亟待研究的课题。

近年来，研究发现，CXCL10/CXCR3轴可趋化免疫细胞至相应部位，进而参与组织炎症、自身免疫性疾病、血管形成等病理生理过程［3］。WU等［4］研究发现，抑制CXCL10/CXCR3轴可以减少嗜酸粒细胞、中性粒细胞以及细胞因子等在胸膜组织的表达。研究发现，雷公藤甲素具有广谱的抗炎和免疫调节作用，在改善哮喘患者临床症状方面具有良好的效果［5］。王立新等［6］研究表明，雷公藤甲素可以减少类风湿性关节炎患者体内CXCL10/CXCR3的表达。然而，雷公藤甲素能否通过调节CXCL10/CXCR3轴减轻哮喘的气道炎症尚缺乏深入研究。本研究通过构建哮喘小鼠模型，探讨雷公藤甲素通过调节CXCL10/CXCR3轴对哮喘小鼠气道炎症的影响及相关机制，以期为临床使用雷公藤甲素治疗哮喘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2020年7—12月选取36只雌性SPF级BALB/c小鼠，周龄6～8周，体质量18～24 g，在符合SPF级实验动物饲养标准的动物房中饲养，所用饲料及纯净水不含致敏原。动物实验遵循西南医科大学医学实验室动物护理和使用委员会以及动物研究伦理委员会要求。

1.2 主要试剂与仪器 卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）购自美国Sigma公司，氢氧化铝粉剂购自成都科隆化学品有限公司，雷公藤甲素购自四川维克奇生物科技有限公司，无水乙醇购自泸州北方化学工业有限公司，超声雾化器购自东莞市健宝电子科技有限公司，IL-4、IL-10、IL-17抗体试剂盒购自科鹿（武汉）生物科技有限责任公司，CXCL10和CXCR3试剂盒购自ASPEN公司。

1.3 哮喘小鼠模型的制备［7］采用简单随机法将36只小鼠均分为对照组、哮喘模型组和雷公藤甲素组，每组12只。哮喘模型组和雷公藤甲素组小鼠在第1、8、15天腹腔注射0.2 ml OVA+氢氧化铝混悬液致敏，小鼠出现呼吸急促、打喷嚏、精神萎靡提示造模成功。对照组小鼠在第1、8、15天腹腔注射0.2 ml 0.9%氯化钠溶液。第22～35天将三组小鼠分别置于封闭纸箱中，哮喘模型组和雷公藤甲素组用10 ml OVA液雾化，激发30 min，每隔2 min晃动纸箱以防止小鼠成堆聚集干扰雾化效果；对照组予以等量0.9%氯化钠溶液雾化。每次雾化前1 h，雷公藤甲素组腹腔注射0.2 ml雷公藤甲素（40 μg/kg），哮喘模型组和对照组则腹腔注射0.2 ml 0.9%氯化钠溶液。

1.4 观察指标

1.4.1 小鼠行为学表现 干预后观察三组小鼠精神状态、呼吸频率、体质量变化、进食饮水等行为学表现。

1.4.2 支气管肺组织形态学变化 三组小鼠最后一次雾化后24 h内采用颈椎脱臼法处死小鼠，取三组小鼠适量左肺组织，采用4%多聚甲醛溶液固定，之后采用液体石蜡浸润肺组织并制作厚度为5 μm的病理切片，将脱蜡、脱水、干燥后的肺组织切片采用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，光镜下观察支气管及其周围组织的病理改变。采用过碘酸-雪夫（periodic acid-schiffstain，PAS）染色，光镜下观察气道上皮杯状细胞及黏液分泌的变化，并采用Image J灰度分析计算PAS染色阳性的杯状细胞占比。

1.4.3 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）检查 三组小鼠被处死后，打开胸腔结扎左主支气管，用1 ml空针针尖插入右主支气管内，采用0.4 ml PBS液灌洗，反复注入和抽吸3次，然后回收BALF。取出BALF在离心机上于4 ℃以1 500 r/min离心10 min（离心半径198 mm），取细胞沉淀制作细胞重悬液，吸取重悬液计数细胞数量，在载玻片上，使用吉姆萨染色后立即封固，冲洗、干燥后在400倍显微镜下观察炎症细胞，分别计数各类炎症细胞数量。取BALF离心后的上清液，采用ELISA测定上清液中IL-4、IL-10、IL-17。操作步骤按试剂盒说明书进行，在450 nm波长处测量各孔样品的吸光度（optical density，OD）值，根据标准曲线计算出各样品中IL-4、IL-10、IL-17。

1.4.4 Western blotting法检测支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量 分别取各组6只小鼠的左肺组织，加入RIPA裂解液，收集上清液，测定总蛋白浓度，参照BCA样品盒试剂说明书检测肺组织匀浆上清液中CXCL10、CXCR3相对表达量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离、转膜、抗体孵育、曝光、显影，采用Image J灰度分析计算CXCL10、CXCR3相对表达量。

1.4.5 免疫组化法检测支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量 分别取各组另外6只小鼠左肺组织，支气管肺组织切片制备方法同1.4.2，免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行，将支气管肺组织切片置于含有枸橼酸钠缓冲液的器皿中，加热至沸腾。冷却、清洗后加入山羊血清，常温搁置30 min后清洗，分别加入抗CXCL10抗体及抗CXCR3抗体（用PBS液代替一抗作为阴性对照），37 ℃孵育30 min，清洗、擦干支气管肺组织切片后加入二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂染色，封固，置于光镜下观察CXCL10和CXCR3的表达情况，采用Graphad Prim 8软件计算CXCL10、CXCR3相对表达量。

1.5 统计学方法 采用Graphad Prim 8软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠行为学表现 干预后对照组小鼠精神状态、呼吸频率、体质量、进食饮水等表现如常，未见明显变化；哮喘模型组小鼠出现精神萎靡、呼吸频率增快、体质量减轻及厌食厌饮等；雷公藤甲素组小鼠精神状态、呼吸频率、体质量变化、进食饮水等行为异常表现较哮喘模型组有所减轻。

2.2 支气管肺组织形态学变化

2.2.1 HE染色结果 对照组小鼠气道上皮结构完整，未见明显炎症细胞浸润及黏液分泌。与对照组比较，哮喘模型组可见气道上皮细胞脱落、炎症细胞浸润、黏液分泌增多，气道平滑肌增生；与哮喘模型组比较，雷公藤甲素组气道上皮细胞脱落、炎症细胞浸润、黏液分泌均减少，见图1。

2.2.2 PAS染色结果 对照组小鼠气道内结构完整，未见明显杯状细胞增生。哮喘模型组可见气道上皮杯状细胞增生，黏液分泌明显增多，PAS染色呈紫红色；与哮喘模型组比较，雷公藤甲素组气道上皮杯状细胞增殖、黏液分泌减少，见图2。对照组、哮喘模型组、雷公藤甲素组气道上皮杯状细胞占比分别为（0.05±0.01）、（0.37±0.14）、（0.25±0.09），差异有统计学意义（F=49.371，P＜0.01）；其中，哮喘模型组、雷公藤甲素组气道上皮杯状细胞占比高于对照组，雷公藤甲素组气道上皮杯状细胞占比低于哮喘模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 三组小鼠支气管肺组织的形态学变化（PAS染色，×200）Figure 2 Morphology of bronchopulmonay tissue in three groups of mice

2.3 BALF结果检查

2.3.1 BALF中细胞总数、炎症细胞计数 三组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，哮喘模型组、雷公藤甲素组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数高于对照组，雷公藤甲素组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数低于哮喘模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组小鼠BALF中细胞总数、炎症细胞计数比较（±s，×105/ml）Table 1 Comparison of cell count and inflammatory cell count in BALF among the three groups of mice

表1 三组小鼠BALF中细胞总数、炎症细胞计数比较（±s，×105/ml）Table 1 Comparison of cell count and inflammatory cell count in BALF among the three groups of mice

注：a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与哮喘模型组比较，P＜0.05

组别 只数 细胞总数 嗜酸粒细胞计数 中性粒细胞计数 淋巴细胞计数对照组 12 2.83±1.90 0.42±0.52 0.25±0.45 1.17±0.58哮喘模型组 12 28.58±3.85a 6.58±1.16a 4.67±1.23a 6.92±1.50a雷公藤甲素组 12 9.00±1.54ab 3.08±2.02ab 1.58±0.79ab 2.83±0.94ab F值 313.16 60.36 78.67 90.61 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3.2 BALF中炎症因子 三组BALF中IL-4、IL-10、IL-17比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，哮喘模型组、雷公藤甲素组BALF中IL-4、IL-17高于对照组，IL-10低于对照组，雷公藤甲素组BALF中IL-4、IL-17低于哮喘模型组，IL-10高于哮喘模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组小鼠BALF中炎症因子比较（±s，pg/ml）Table 2 Comparison of inflammatory factor in BALF among the three groups of mice

注：IL=白介素；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与哮喘模型组比较，P＜0.05

组别 只数 I L-4 I L-1 0 I L-1 7对照组 1 2 1 7.2 9±3.6 9 1 5.8 1±1.0 3 1 9.4 3±4.1 9哮喘模型组 1 2 6 6.3 1±4.4 3 a 1 1.4 6±1.9 9 a 7 0.0 3±3.6 1 a雷公藤甲素组 1 2 3 9.4 6±3.1 5 ab 1 3.9 3±1.3 8 ab 4 2.9 6±3.5 1 ab F值 5 0 2.4 1 2 4.6 1 5 3 7.7 1 P值 ＜0.0 1 ＜0.0 1 ＜0.0 1

2.4 支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量

2.4.1 Western blotting法结果 Western blotting法结果显示，三组支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，哮喘模型组、雷公藤甲素组支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量高于对照组，雷公藤甲素组支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量低于哮喘模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图3。

图3 Western blotting法检测三组小鼠支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量Figure 3 Relative expression of CXCL10 and CXCR3 in bronchopulmonay tissue detected by Western blotting in the three groups of mice

表3 三组小鼠支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量比较（Western blotting法）（±s）Table 3 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice （Western blotting）

表3 三组小鼠支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量比较（Western blotting法）（±s）Table 3 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice （Western blotting）

注：a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与哮喘模型组比较，P＜0.05

组别 只数 CXCL10 CXCR3对照组 6 0.15±0.02 0.21±0.01哮喘模型组 6 0.73±0.03a 0.63±0.03a雷公藤甲素组 6 0.41±0.19ab 0.39±0.02ab F值 1 040.00 507.86 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.4.2 免疫组化法结果 免疫组化法结果显示，三组支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，哮喘模型组、雷公藤甲素组支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量高于对照组，雷公藤甲素组支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量低于哮喘模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图4。

图4 免疫组化法检测三组小鼠支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量（×200）Figure 4 Relative expression of CXCL10 and CXCR3 in bronchopulmonay tissue detected by immunohistochemical in the three groups of mice

表4 三组小鼠支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量比较（免疫组化法）（±s）Table 4 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice（immunohistochemistry）

表4 三组小鼠支气管肺组织中CXCL10、CXCR3相对表达量比较（免疫组化法）（±s）Table 4 Comparison of relative expression of CXCL10，CXCR3 in bronchopulmonay tissue among the three groups of mice（immunohistochemistry）

注：a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与哮喘模型组比较，P＜0.05

组别 只数 CXCL10 CXCR3对照组 6 1 369.33±8.94 321.67±3.08哮喘模型组 6 7 331.50±10.75a 5 172.17±7.94a雷公藤甲素组 6 4 702.00±6.29ab 1 587.17±5.64ab F值 683 948.53 1 093 504.77 P值 ＜0.01 ＜0.01

3 讨论

哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病，其治疗大多使用糖皮质激素、β2-受体激动剂和白三烯调节剂。其中，糖皮质激素是控制哮喘气道炎症最有效的药物［8］。但部分患者对激素治疗并不敏感，且长期使用激素会导致如骨质疏松、血糖升高等不良反应［2］。虽然近年来治疗哮喘的靶向药物如奥马珠单抗、美泊利单抗等对部分哮喘患者有一定的效果，但由于其治疗费用昂贵，有些药物还未在国内上市［9-11］。因此，仍有必要寻找有效、价廉、可降低疾病负担的抗炎药物，以提高哮喘的控制水平、患者的生活质量。

雷公藤甲素是一种二萜三环氧化物，是一种从雷公藤中分离出来的具有抗炎和免疫抑制作用的中药活性化合物［5］。雷公藤甲素除了对自身免疫性疾病、皮肤疾病等有良好的治疗效果外，还被证实具有抗气道炎症的作用［12］。张朝顺等［13］研究发现，雷公藤甲素可以减少外周血和骨髓中嗜酸粒细胞数量；WEI等［14］研究发现，雷公藤甲素可以通过调节哮喘动物模型中炎症细胞相关信号转导和转录激活因子（如STAT3和STAT5）来影响Th17和Tregs的分化，从而减少气道内IL-4、IL-17等炎症递质的表达；YANG等［15］研究证实，雷公藤甲素还可以抑制肥大细胞产生组胺、半胱氨酸、白三烯等炎症递质，从而发挥抗气道炎症作用；此外，雷公藤甲素还能通过抑制巨噬细胞产生一氧化氮和活性氧，抑制NF-κB活化和JNK磷酸化来减轻炎症细胞（嗜酸粒细胞及中性粒细胞）对气道的浸润，并促进抗炎因子IL-10的表达［15-16］。

CXCL10/CXCR3轴与哮喘关系密切［17］。BRIGHTLING等［18］对哮喘患者支气管黏膜活检提示，在哮喘患者气道内可见较正常人更多的CXCR3与CXCL10，且CXCR3与CXCL10的表达水平与气道炎症呈正相关。研究已证实，CXCR3基因缺失（CXCR3-/-）小鼠气道中中性粒细胞及淋巴细胞的浸润明显减少，在使用中和抗体阻断CXCL10后，小鼠支气管肺组织中的嗜酸粒细胞浸润也明显减少［19-20］。研究发现，CXCL10与CXCR3结合，可以激活机体内ERK和MAPK途径，从而诱导嗜酸粒细胞趋化至炎症部位，进而引发炎症反应［21］。TAKAKU等［22］研究发现，CXCL10和CXCR3在以中性粒细胞为主的哮喘表型中增多。在哮喘患者中，CXCL10与CXCR3结合可以激活中性粒细胞并将其吸引到气道内。WU等［4］研究证实，IL-10缺失可以促进CXCL10与CXCR3的结合，继而导致Th1细胞表达的IL-4和Th17细胞表达的IL-17在恶性胸腔积液中增加。王立新等［6］研究证实，雷公藤甲素可以减少类风湿关节炎患者体内CXCL10/CXCR3的表达，从而减轻机体内的炎症反应。然而，雷公藤甲素能否通过调节CXCL10/CXCR3轴来减轻哮喘小鼠的气道炎症尚缺乏相关研究。

本研究采用雷公藤甲素干预哮喘小鼠，结果显示：与哮喘模型组比较，雷公藤甲素组气道上皮杯状细胞增多、黏液分泌减少；BALF中嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞计数降低，同时促炎因子IL-4、IL-17降低，而抑炎因子IL-10却升高。已有研究表明，炎症细胞及细胞因子受CXCL10/CXCR3轴的调控［23-24］。而本研究发现，在雷公藤甲素组，调控气道炎症细胞（嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）在气道的浸润及炎症因子（IL-4、IL-17、IL-10）在气道中表达的CXCL10与CXCR3也减少，表明雷公藤甲素可能通过调控CXCL10/CXCR3轴而抑制气道炎症。

综上所述，雷公藤甲素能够减少哮喘气道上皮杯状细胞及BALF中嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞，下调促炎因子IL-4、IL-17，上调抑炎因子IL-10，同时抑制CXCL10和CXCR3的表达，继而减轻哮喘小鼠模型气道炎症，这可能与雷公藤甲素可调控CXCL10/CXCR3轴有关。本研究为雷公藤甲素治疗哮喘提供了理论依据。但本研究也存在不足：一是，雷公藤甲素组仅设置了一个给药剂量，未分析不同剂量梯度对哮喘小鼠气道炎症的作用，不清楚雷公藤甲素的抗炎作用是否存在剂量依赖性；二是，未观察雷公藤甲素对哮喘小鼠的不良反应，这些问题有待进一步研究。

作者贡献：任强对文章进行构思与设计，资料收集与整理，论文撰写；邓俊进行研究的实施与可行性分析；周进进行统计学处理；任强、张沄进行论文修订；王宋平负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。