玉米须多糖发酵工艺优化及其抗氧化活性研究

胡楠楠，亓伟华，尤丽新，秦凤贤*

（1.长春科技学院 生命科学学院，吉林 长春 130600；2.吉林省功能性食品产业工程研究中心，吉林 长春 130600）

玉米须（Stigma maydis）是玉米的花柱和柱头，大部分的玉米须通过烧掉或废弃扔掉等方式进行处理，不仅造成了极大的环境污染，同时也带来了有效资源的浪费[1]。玉米须中含有很多生理活性物质，包括黄酮类化合物[2-3]、花青素[4]、多糖[5-6]、甾醇[7]等。玉米须多糖具有保护肠道[8]、抗氧化[9]、降血糖[10-11]、抗肿瘤[12]等生理功能。

目前，关于玉米须多糖的提取方法研究较多，有化学法[13-14]、物理法[15-16]、物理或化学辅助生物酶法[17]。而生物发酵法制备玉米须多糖目前鲜见报道，生物发酵法是利用菌株发酵产生的淀粉酶、蛋白酶等水解原料中淀粉、蛋白质为微生物的生长代谢提供碳源和氮源，同时生成纤维素酶等代谢产物，得到多糖。食用菌是公认的安全菌株，食用菌生长过程中可生成淀粉酶，蛋白酶等多种酶系。淀粉酶和蛋白酶利用原料中的淀粉和蛋白质，为微生物的生长繁殖提营养物质，提高了原料的利用率。同时，它使得微生物产酶与酶解过程合二为一，省去了酶解反应过程中的分离纯化过程[18]。由于食用真菌“药食同源”的特点，利用食用真菌发酵制备多糖已经成为研究热点。董玉玮等[19]利用固体发酵灵芝产多糖，得到多糖含量为24.85 mg/g。HU W等[20]对猴头菇发酵菌丝体的多糖进行纯化。

本研究玉米须为原料，以黑木耳（Auricularia auricula）为菌株，采用液体发酵制备玉米须多糖，通过单因素试验和响应面试验优化其发酵工艺条件，并考察玉米须多糖清除羟基自由基及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力，为提高玉米须资源的附加值，为其深度开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原材料

黑木耳（Auricularia auricula）、马铃薯、玉米须（自然晾干，粉碎，过100目）：市售。

1.1.2 化学试剂

葡萄糖、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁，维生素B1（vitamin B1，VB1）、维生素C（vitamin C，VC）、乙醇、氯化亚铁、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、氢氧化钠（均为分析纯）：北京化工厂；溴化钾（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；水杨酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；DPPH（分析纯）：上海瑞永生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

菌种培养基：200 g马铃薯切块，加水煮沸30 min，过滤，滤液中添加15 g葡萄糖，充分溶解后过滤，加水定容至1 L，分装，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

发酵培养基：取10 g粉碎玉米须置于1 L蒸馏水中，调节pH值为6.0，50 ℃保温2 h，添加30 g葡萄糖、4 g酵母粉、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O和0.1 g VB1。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；MLS-37型高压蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；HZQ全温振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；BCN-1360净化工作台：上海新苗医疗器械制造有限公司；Cary 300 scan紫外可见分光光度计：美国瓦里安VARIAN公司；VERTEX70傅里叶红外光谱仪：德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米须粗多糖的制备

母种培养液的制备：向装液量为50 mL/250 mL的菌种培养基中接种质量为1 g的菌株，在温度25 ℃，摇床转速100 r/min条件下培养5 d，得到母种培养液。

发酵液的制备：在装液量为60 mL/250 mL的发酵培养基中接种一定量的母种培养液，在设定的温度下、摇床转速100 r/min培养一定的时间。

玉米须粗多糖的制备：将发酵液冻干，得到玉米须粗多糖。

1.3.2 分析检测

（1）发酵液中多糖含量测定[21]

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。配制0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液，分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL及0.5 mL葡萄糖标准溶液，各试管用蒸馏水补至1.0 mL。加入0.5 mL 6%的苯酚溶液和2.5 mL的浓硫酸后振荡混匀，静置冷却30 mL，以蒸馏水1 mL同等操作为空白对照，于波长490 nm处测定吸光度值。以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。得到标准曲线线性回归方程：y=0.024 7x+0.018 7，相关系数R2=0.994 7。

将发酵液根据标准曲线的方法进行处理。于波长490nm处测定吸光度值，代入葡萄糖标准曲线回归方程中计算多糖含量。

（2）发酵液中纤维素酶活性测定[22]

纤维素酶可以水解玉米须中的纤维素，有利于多糖的溶出，因此纤维素酶活也是一个重要指标。

取50 mg滤纸，剪碎后加至4.0 mL 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 5.0）中，加热至50 ℃；添加1 mL发酵液于混合物中，50 ℃水浴保持2 h，采用加热法终止酶反应（95 ℃、10 min）；冷却后用DNS比色法测定酶解液中还原糖增加量。纤维素酶酶活定义：1 mL粗酶液单位时间（1 min）内50 ℃水解滤纸产生l μmol葡萄糖定义为一个酶活单位（U/mL）。

纤维素酶酶活计算公式如下：

式中：X为试样纤维素酶的活性，U/g；m为根据标准曲线方程上计算得到的的葡萄糖的质量，mg；M为葡萄糖的摩尔质量，180.2 g/mol；t为酶解反应时间，min；1 000为单位换算因子，1 mmol=1 000 μmol；n为稀释倍数。

（3）粗多糖红外光谱分析[19]

取2 mg冻干后的玉米须粗多糖样品，加入200 mg kBr充分研磨后，进行压片，在波数400～4 000 cm-1范围内用红外光谱仪进行扫描。

1.3.3 发酵工艺优化

（1）单因素试验

以接种量7%，发酵温度25 ℃，发酵时间6 d为基础培养条件，分别单独考察接种量（3%、5%、7%、9%、11%）、发酵温度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃）和发酵时间（2 d、4 d、6 d、8 d和10 d）对发酵液中多糖含量和纤维素酶活的影响。

（2）响应面试验

利在单因素试验的基础上，以发酵液中多糖含量（Y）为响应值，采用Design-Expert8.0.6软件对接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）3个因素进行响应面设计，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 玉米须粗多糖的抗氧化活性测定

（1）对·OH的清除作用

于10mL具塞试管中依次加入2mL质量浓度为1mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的样品溶液、0.5 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL 9 mmol/L FeCl2溶液、6.5 mL去离子水和0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混合均匀，37 ℃水浴反应1 h，反应结束后以蒸馏水调零，在波长510 nm处测吸光度值，以VC作为阳性对照[23]。·OH的清除率计算公式如下：

式中：A1为样品溶液的吸光度值；A2为去离子水代替FeCl2的吸光度值；A3为去离子水代替样品溶液的吸光度值。

（2）对DPPH·的清除作用

于试管中加入2 mL质量浓度分别为1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的样品溶液和2 mL 0.5 mmol/L的DPPH溶液（以体积分数95%乙醇配制），混匀后，室温下避光反应30 min，反应结束后在波长517 nm处测定吸光度值。以VC作为为阳性对照。DPPH·的清除率计算公式如下[24]：

式中：A1为样品溶液的吸光度值；A2为体积分数95%乙醇代替DPPH溶液的吸光度值；A3为去离子水代替样品溶液的吸光度值。

1.3.5 数据处理

利用SPSS 21.0进行数据分析，采用Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计，采用Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 玉米须多糖发酵工艺优化的单因素试验

2.1.1 接种量对多糖含量和纤维素酶活的影响

对黑木耳进行母种培养后，在装液量为60 mL/250 mL的三角瓶中分别接种3%、5%、7%、9%和11%的母种培养液，25 ℃摇床培养（100 r/min）6 d，测定发酵液中多糖含量和纤维素酶活的结果见图1。

图1 接种量对多糖含量和纤维素酶活的影响Fig.1 Effect of inoculum on polysaccharide content and cellulase activity

由图1可知，随着接种量在3%～11%范围内的增加，多糖的含量和纤维素酶活均呈现先增加后减小的趋势。当接种量为3%～7%时，多糖含量和纤维素酶活均随之升高；当接种量为7%时，糖含量和纤维素酶活分别为12.2 mg/L和117.5 U/L，均达最大值；当接种量＞7%之后，多糖含量和纤维素酶活有所下降。这可能是由于当接种量增加到一定程度时，可以利用的玉米须发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐等营养物质有限，不利于发酵代谢产物的产生[25]。因此，选择最佳接种量为7%。

2.1.2 发酵温度对多糖含量和纤维素酶活的影响

温度是影响微生物生长、代谢产物积累的主要因素之一，而且，温度还会影响酶的活性，影响酶促反应的进行，最终影响代谢产物的合成。对黑木耳进行母种培养后，在装液量为60 mL/250 mL的三角瓶中接种7%的母种培养液，发酵温度分别为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的条件下摇床培养（100 r/min）6 d，测定发酵液中多糖含量和纤维素酶活的结果见图2。

图2 发酵温度对多糖含量和纤维素酶活的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on polysaccharide content and cellulase activity

由图2可知，随着发酵温度在15～35 ℃范围内的升高，多糖的含量和纤维素酶活均呈现先增加后减小的趋势。当发酵温度为15～25 ℃时，多糖含量和纤维素酶活均随之升高；当发酵温度为25 ℃时，多糖含量和纤维素酶最高，分别为12.52 mg/L和126.4 U/L；当发酵温度高于25 ℃之后，多糖含量和纤维素酶活有所下降。因此，选择最佳发酵温度为25 ℃。

2.1.3 发酵时间对多糖含量和纤维素酶活的影响

对黑木耳进行母种培养后，在装液量为60 mL/250 mL的三角瓶中接种7%的母种培养液，在温度为25 ℃的条件下摇床（100 r/min）分别培养2 d、4 d、6 d、8 d和10 d，测定发酵液中多糖含量和纤维素酶活的结果见图3。

图3 发酵时间对多糖含量和纤维素酶活的影响Fig.3 Effects of fermentation time on polysaccharide content and cellulase activity

由图3可知，随着发酵时间在2～10 d范围内延长，多糖含量和纤维素酶活均呈先增加后减小的趋势。当发酵时间为2～6 d时，多糖含量和纤维素酶活均随之升高；当发酵时间为6 d时二者达到峰值，分别为12.5 mg/L和121.7 U/L；当发酵时间超过6 d之后，多糖含量和纤维素酶活均有所下降。发酵初期营养充足，多糖逐渐积累，发酵后期营养匮乏，生长环境改变，菌体进入衰亡期，酶活降低，代谢产物不再积累。因此，选择最佳发酵时间为6 d。

2.2 响应面试验结果

基于单因素试验结果，以多糖含量（Y）作为响应值，选取接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，进行响应面分析，试验设计结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

将表2试验数据采用Design Expert 8.0.6软件进行非线性多元回归统计分析，建立二次多项式的拟合，得到回归方程如下：Y=12.4+0.7A+0.83B+0.47C+0.075AB+1.03AC-0.52BC-1.56A2-1.46B2-0.66C2。

由表3可知，此模型回归显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），决定系数R2为0.971 4，表明97.14%试验结果能由此方程解释，校正决定系数R2adj为0.934 7，反映了93%左右的多糖含量变异散布于接种量、发酵温度及发酵时间3个因素内，说明模型拟合度较好[24]。变异系数（coefficient of variation，CV）为3.83%，该值反映每个平均值相对偏离情况，试验稳定性越好CV值越小，因此可以看出本试验具备相对高的置信度及可靠性。综上分析，该响应面试验可以用于黑木耳发酵玉米须制备多糖的参数预测。由表3中F值可知，影响多糖含量的主次顺序为：B（发酵温度）＞A（接种量）＞C（发酵时间）。由P值可知，一次项A、B，交互项AC及二次项A2、B2对响应值影响作用均达极显著水平（P＜0.01），一次项C，交互项BC及二次项C2对响应值影响作用均达显著水平（P＜0.05）。

2.3 响应面曲面图分析

运用Design-Expert 8.0.6软件得到各因素交互作用对多糖含量影响的响应面及等高线见图4。3个响应面曲面均为凸形，发酵过程中的参数变化对多糖含量会产生不同的影响。在所选取的试验范围内，响应值存在极大值，可以模拟出该试验的最优条件，响应面越陡，反映出各因素之间的两两交互作用越显著。由图4a可知，接种量和发酵温度的曲面图较平缓，因素间交互作用较小，由图4b和4c可知，发酵时间和接种量、发酵温度和发酵时间的曲面图较陡，交互作用对结果影响显著（P＜0.05），这与方差分析结果一致。随着发酵时间的增大，多糖的含量先增加，而后在较高接种量时，增幅不大。

图4 各因素交互作用对多糖含量影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on polysaccharide content

2.4 验证试验结果

由Design-Expert 8.0.6软件得出最佳发酵工艺条件为：接种量8%、发酵温度26 ℃、发酵时间7 d。在此条件下得到玉米须多糖含量理论值为12.77 mg/L。此优化条件下进行3次平行验证试验，得到多糖含量实际值为13.12 mg/L，与理论值12.77 mg/L接近，其发酵液中纤维素酶的活力为130.7 U/L，说明该模型能较好地预测实际多糖含量。

2.5 玉米须粗多糖的红外光谱鉴定

由图5可知，波数3 392 cm-1处的宽吸收峰在3 200～3600cm-1范围内，为饱和的O-H伸缩振动区域，波数2929cm-1的吸收峰在2 800～3 000 cm-1范围内，为饱和C-H伸缩振动吸收峰；波数1 200～1 400 cm-1范围内出现的吸收峰属于C-H的变角振动，波数1 632 cm-1处吸收峰为C=O的非对称伸缩振动吸收峰，波数1 421 cm-1附近吸收峰为C-H的变形振动吸收峰[26]，这些区域所出现的峰均为糖类的特异吸收峰。

图5 玉米须粗多糖的红外光谱测定结果Fig.5 Determination results of infrared spectrum of Stigma maydis crude polysaccharide

2.6 玉米须粗多糖的抗氧化能力分析

由图6a可知，玉米须粗多糖对·OH的清除能力存在浓度依赖关系，在10 mg/mL的质量浓度时，多糖对·OH的清除能力与0.1 mg/mL VC持平。玉米须粗多糖对·OH的最大清除率为40%左右。由图6b可知，黑木耳发酵玉米须多糖清除DPPH·的能力较强，但弱于VC。质量浓度在1～10 mg/mL范围内，多糖的清除能力与溶液质量浓度成正比例关系，在多糖质量浓度为10 mg/mL时，其清除率为43.3%。

图6 玉米须粗多糖对·OH（a）和DPPH·（b）的清除能力Fig.6 Scavenging ability of Stigma maydis crude polysaccharide on·OH (a) and DPPH·(b)

3 结论

在单因素试验的基础上对黑木耳发酵玉米须的工艺条件进行优化，优化发酵工艺条件：接种量为8%、发酵温度为26 ℃、发酵时间为7 d。此优化条件下，多糖含量为13.12 mg/L，其发酵液中纤维素酶的活力为130.7 U/L，说明该模型能较好地预测实际提取量。并对得到的多糖进行红外光谱分析和抗氧化能力分析，结果表明其红外谱图具有糖类物质的特征吸收峰，且多糖对羟基（OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基最大清除率分别为34.5%和43.3%，后续研究可以对粗多糖对进行纯化，以提高其抗氧化活性。